柱前衍生-HPLC 法测定五指毛桃中16 种游离氨基酸含量

陈荣珠，王小平，高伟城，陈育青，丁其春

（漳州卫生职业学院药学系，福建漳州 363000）

五指毛桃始载于岭南地区的民间药书《生草药性备要》，为桑科植物粗叶榕Vahl 的干燥根，有五爪龙、五指牛奶、南芪等别称，在《中药志》、《全国中草药汇编》、《中华本草》等大型辞书中均有简述，收录于《广西壮族自治区瑶药材质量标准（第一卷）》（2013 年版）、《广东省中药材标准》（2004 年版）、《湖南省中药材标准》（2009 年版）。五指毛桃主要分布于我国的广东、福建、云南、贵州、广西等地。五指毛桃既是中草药，也是食用佳品，近年来，其研究主要集中在化学成分的测定和生理活性评价等方面，其化学成分主要有黄酮类、苯丙素类、甾体类、萜类、酚类和挥发油类等。经研究发现，五指毛桃中的活性物质具有抗炎、抗氧化、提高免疫及保肝等作用。药理活性表现为调节免疫系统、改善呼吸和胃肠道功能，对药物、拘束应激性及酒精性肝损伤具有保护作用，且能抗衰老、抗氧化、抑菌及抗辐射等。

氨基酸既是药用植物中的一种生物活性物质，也是蛋白质的水解产物，在人体中发挥着重要的作用，参与人体生长、代谢、免疫及抗氧化，还是食品质量及营养价值的重要评价指标。氨基酸与人体生命活动息息相关，游离氨基酸可直接被人体吸收，可形成维生素E、叶酸等营养素。游离氨基酸的种类和含量的变化会对中药材或食物的品质、营养价值及香气物质造成一定的影响。不同氨基酸具有不同的生理功能，丙氨酸能提高免疫系统，防治血管疾病；谷氨酸参与红细胞的生成，也能治疗神经衰弱和记忆力减退；脯氨酸参与血红蛋白的合成；精氨酸能促进胰岛素的生成与分泌，促进创口愈合；赖氨酸与人体代谢平衡和儿童智力发育等均有关。

我国中药材研究历史悠久，随着其化学成分及活性物质研究的深入，中药材的品质评价体系日趋完善，常见中药材中氨基酸含量和组分测定也陆续完成，如重楼、桑叶、天花粉、三七、天麻等多种中药材中的氨基酸含量已完成了测定，然而关于五指毛桃中游离氨基酸的研究未见报道。氨基酸的分析方法主要有氨基酸自动分析仪、毛细管电泳法、高效液相色谱法和气相色谱法等，其中，柱前衍生高效液相色谱法检测简便、准确高效，最为常用，以上中药材中氨基酸含量的测定就是用此方法进行的。本研究拟采用异硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相色谱法（PITC-HPLC）测定不同叶形、不同产地五指毛桃根中L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸等16 种游离氨基酸的含量，以期为五指毛桃品种选育、开发利用及质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

12 份五指毛桃取自不同产地，植株经漳州卫生职业学院陈育青副教授鉴定为桑科植物粗叶榕，采集详细信息见表1。

表1 样品信息Table 1 The information of samples

16 种氨基酸混合标准品：L-天门冬氨酸（LAsp）、L-谷氨酸（L-Glu）、L-丝氨酸（L-Ser）、甘氨酸（Gly）、L-组氨酸（L-His）、L-精氨酸（L-Arg）、L-苏氨酸（L-Thr）、L-丙氨酸（L-Ala）、L-脯氨酸（L-Pro）、L-酪氨酸（L-Tyr）、L-缬氨酸（L-Val）、L-甲硫氨酸（LMet）、L-异亮氨酸（Ile）、L-亮氨酸（L-Leu）、L-苯丙氨酸（L-Phe）、L-赖氨酸（L-Lys） Sigma 公司，批号为SLCF7767，浓度为2.5 μmol/mL；乙腈 色谱纯，Fisher 公司；异硫氰酸苯酯（PITC） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；三乙胺、正己烷、无水醋酸钠、冰乙酸、无水乙醇、盐酸（优级纯） 西陇科学股份有限公司；水为超纯水；以上试剂无特殊说明均为分析纯。

Agilent 1260 型高效液相色谱仪、Agilent ZORBAX SB-C色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Agilent 公司；Ultimate Amino Acid 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 月旭科技（上海）股份有限公司；PE20K 型pH 计 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；101A-3B 电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司；PX224ZH/E 型电子天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；TG16-WS 台式高速离心机 湖南湘仪离心机有限公司；KQ-250 DE 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HWS-28 型电热恒温水浴锅 常州市江南实验仪器厂；XL-04B 密封型摇摆式粉碎机 广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备 五指毛桃溶液制备的操作步骤如下。将五指毛桃根洗净后阴干，再用60 ℃烘箱烘干，然后将样品粉碎后过60 目筛；精密称取粉末0.10 g 置于真空接口蛋白质水解管中，加入10 mL 6 mol/L 盐酸溶液，充氮气；置于120 ℃油浴锅中水解12 h，放冷过滤，移入蒸发皿中，置于水浴锅上蒸干，残渣加入0.1 mol/L 盐酸溶液溶解并转移到2 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液至刻度，摇匀；最后，将溶液全部转移到离心管中，10000 r/min，离心15 min，取上清液置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 柱前衍生化 准确吸取氨基酸混合对照品溶液（2.5 μmol/mL）及供试品溶液各200 μL，分别加入0.1 mol/L 异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液（取PITC 0.12 mL，用乙腈定容至10 mL）和1 mol/L 三乙胺乙腈溶液（取三乙胺1.35 mL，加乙腈定容至10 mL）各100 μL，混匀，置于室温中反应l h，然后加入正己烷400 μL 萃取，振荡10 s，放置10 min，重复3 次，取下层溶液200 μL，用超纯水定容至1.4 mL 后用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液即得。

1.2.3 色谱条件 本试验使用Agilent 1260 型高效液相色谱仪和Ultimate Amino Acid 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色谱柱柱温为40 ℃；检测波长为254 nm；进样量20 μL；流速为1.0 mL/min；流动相A：以0.1 mol/L 的醋酸钠（pH6.50，A）和无水乙腈（B）作为流动相进行梯度洗脱（0～4 min，95%A；4.01～31 min，95%A→67%A；31.01～40 min，67%A→65%A；40.01～45 min，65%A→10%A；45.01～53 min，10%A；53.01～55 min，10%A→95%A；55.01～67 min，95%A）。五指毛桃根中16 种氨基酸含量的测定采用外标法（标准曲线法）计算。

1.3 数据处理

本文表中数据表示形式为平均值±标准差；用SPSS 26.0 进行数据整理和分析，并采用单因素方差分析法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 供试品溶液提取方法的考察

考虑到试验的安全性及提取效率，结合参考文献[29]，本试验考察了样品在120 ℃下用6 mol/L 盐酸分别水解10、12、16 h 后各种氨基酸含量及16 种氨基酸总含量存在显著差异（＜0.05）。结果如表2所示，水解10 h 时L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸含量和L-总氨基酸含量显著低于水解12 和16 h（＜0.05），其原因可能是水解10 h 不能充分将药材中的氨基酸全部水解，而水解12 和16 h 后各种氨基酸含量及氨基酸总含量无显著性差异（＞0.05）。为保证水解完全并提高效率，最终确定样品水解条件为6 mol/L盐酸、120 ℃下水解12 h。

表2 广东河源源城区源南镇五指毛桃不同油浴时间16 种氨基酸含量测定结果（mg/g，n=3）Table 2 The content of 16 kinds of amino acids in Ficus hirta from Yuannan town, Heyuan, Guangdong Province (mg/g, n=3)

2.2 色谱柱的选择

本试验考察了Ultimate Amino Acid 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）在相同流动相下的分离效果。结果如图1 所示，氨基酸对照品用Ultimate Amino Acid 色谱柱分离效果良好。因此，本试验选用Ultimate Amino Acid 色谱柱进行后续试验。

图1 16 种混合氨基酸标准品在Ultimate Amino Acid 柱（A）和Agilent ZORBAX SB-C18 柱（B）中的液相色谱图Fig.1 The chromatogram of 16 amino acids on Ultimate Amino Acid (A) and Agilent ZORBAX SB-C18 (B) columns

2.3 流动相体系的选择

本试验在流动相体系的选择上，考察了等度洗脱和梯度洗脱这两种流动相体系下氨基酸的分离情况。结果表明，等度洗脱无法将氨基酸混合对照品进行有效分离（图2），改用梯度洗脱的方式后16 种氨基酸对照品能有效分离，梯度洗脱参照李松涛等对桑叶中氨基酸含量测定所用的流动相体系，略作更改，结果发现，在此流动相体系下，16 种氨基酸能有效分离，满足实验要求。在前述优化的色谱条件下对标准品和样品进行测定，16 种氨基酸混合标准品及五指毛桃根提取液的液相色谱图见图3。

图2 等度洗脱色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of isometric elution

图3 供试品溶液（A）、混合对照品溶液（B）、空白溶液（C）色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of derivatized solution of sample (A)，mixed reference standard solution (B)，and blank solution (C)

2.4 线性关系、检出限及定量限测定结果

精密移取氨基酸混合对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，用0.1 mol/L 的盐酸稀释至刻度，摇匀，并按“1.2.2”方法进行衍生化，依据本实验的色谱条件测定峰面积。以氨基酸对照品峰面积（Y）对进样量（X，μg）绘制标准曲线，计算回归方程。采用0.1 mol/L 盐酸溶液不断稀释处理氨基酸对照品溶液，与空白溶剂进样，进样量为20 μL，依信噪比法初步预估检出限和定量限，其中，以信噪比为3:1 时确定检出限，以信噪比为10:1 时确定定量限。结果如表3 所示，L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸分别在0.381～5.950、0.421～7.692、0.301～5.969、0.215～7.633、0.444～6.008、0.498～6.714、0.341～5.936、0.255～3.8717、0.329～4.520、0.518～6.681、0.335～6.130、0.427～4.254、0.375～4.932、0.375～6.744、0.472～4.544、0.418～5.171 μg 范围内均有良好的线性关系，相关系数均大于0.9992，检出限为0.364～1.052 ng/mL，定量限为1.394～4.207 ng/mL，表明仪器灵敏度高，较低质量浓度的氨基酸即可被检测。

表3 16 种氨基酸的标准曲线、相关系数、检出限和定量限Table 3 The regression equations, correlation coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) for 16 kinds of amino acids

2.5 精密度、重复性、稳定性及加样回收率测定结果

2.5.1 精密度测定结果 精密吸取氨基酸混合对照品溶液（2.5 μmol/mL），按“1.2.3”项色谱条件下连续进样6 次，测定各种氨基酸的峰面积并计算其RSD，结果测得L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-赖氨酸峰面积的RSD 分别为1.08%、1.85%、1.16%、0.87%、2.20%、1.91%、0.37%、1.18%、1.15%、0.68%、0.54%、0.37%、1.09%、1.20%、0.61%、1.06%，说明该仪器精密度良好。

2.5.2 重复性测定结果 精密称取6 份广东河源源城区源南镇的五指毛桃粉末，每份0.10 g，按“1.2.1”和“1.2.2”项下方法制备溶液并进行衍生化，按上述“1.2.3”项下色谱条件测定含量，结果发现，L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-赖氨酸的平均含量分别为2.91、3.41、3.07、 3.75、 1.88、 8.21、 3.30、 5.01、 4.69、 1.23、4.81、 0.35、 3.71、 5.51、 3.61、 4.02 mg/g， RSD分别为1.91%、1.63%、2.01%、1.47%、1.29%、1.85%、1.71%、0.59%、1.88%、0.93%、1.72%、1.39%、1.31%、1.65%、1.50%、0.67%，说明该方法重复性好。

2.5.3 稳定性试验 精密称取6 份广东河源源城区源南镇的五指毛桃粉末，每份0.10 g，分别按“1.2.1”和“1.2.2”项下方法制备溶液并进行衍生化，按“1.2.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积，计算RSD。结果发现，L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-赖氨酸等16 种氨基酸峰面积的RSD 分别为1.33%、1.17%、0.64%、1.37%、0.89%、1.49%、 0.51%、 1.20%、 1.94%、 0.59%、 1.01%、1.18%、0.30%、1.76%、1.41%、2.27%，表明供试品溶液在室温条件下24 h 内，稳定性良好。

2.5.4 加样回收率测定结果 精密称取6 份福建漳州龙文区五指毛桃粉末，每份约0.05 g，精密加入与样品中待测成分含量相当的氨基酸混合对照品溶液，分别按“1.2.1”和“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液并进行衍生化，按“1.2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。由表4 可知，16 种氨基酸的平均加样回收率为98.1%～105.9%，RSD 为0.67%～2.11%，说明该方法准确度高。

表4 加样回收试验结果（n=6）Table 4 The results of recovery test (n=6)

2.6 样品测定结果

精密称取12 份五指毛桃粉末各0.10 g，按“1.2.1”项中的方法制备溶液，并按“1.2.2”项下方法进行衍生化，然后按“1.2.3”项下色谱条件进样测定，将测得的峰面积代入回归方程，分别计算16 种氨基酸的含量，如表5、表6 所示。从表5 中的结果可知，9 个产地12 份样品均检测到16 种氨基酸，总含量范围为33.32～72.94 mg/g。16 种氨基酸中L-精氨酸和L-亮氨酸平均含量最高（4.549 mg/g），其次是L-丙氨酸、L-脯氨酸和L-缬氨酸，而L-组氨酸和L-酪氨酸平均含量相对较低，L-甲硫氨酸平均含量最低。亮氨酸和精氨酸作为一种调节因子，可以调控细胞内信号通路，并对细胞内蛋白合成、周转及机体免疫和氧化功能等方面有着重要的生物学作用；亮氨酸能削弱抗阻运动所导致的骨骼肌损伤与疼痛，可促进骨骼肌蛋白质合成。这与民间将五指毛桃根作为药膳用于提高免疫力、治疗骨损伤与疼痛是相符的。

表5 不同叶形五指毛桃根中氨基酸的含量（mg/g，n=3）Table 5 The content of amino acids in Ficus hirta from different leaf shapes (mg/g, n=3)

表6 不同产地五指毛桃根中氨基酸的含量（mg/g, n=3）Table 6 The content of amino acids in Ficus hirta from different area (mg/g, n=3)

采自漳州卫生职业学院的不同叶形五指毛桃根中（表5），16 种氨基酸总含量并没有随着叶裂数目的增加而增加，四种叶形总氨基酸含量由高到低为三指＞七指＞五指＞全缘，总含量介于42.63～61.32 mg/g。其中，三指浅裂五指毛桃根中甘氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸及L-赖氨酸的含量显著（＜0.05）高于其它三种叶形。

同时，分析了8 个不同产地五指毛桃根中（表6）16 种氨基酸含量，其总含量介于33.32～72.94 mg/g。进一步分析发现除了L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-苯丙氨酸，其它11 种氨基酸含量及16 种氨基酸总含量广西钦州灵山县显著（＜0.05）高于其它产地，福建漳州平和县的五指毛桃根中L-天门冬氨酸含量显著（＜0.05）高于其它产地，广东河源源城区源南镇五指毛桃根中L-组氨酸含量显著（＜0.05）高于其它产地，广西钦州灵山县和广东河源源城区源南镇五指毛桃根中L-苏氨酸含量显著（＜0.05）高于其它6 个产地。因此，同一种中药材种植在不同地区，受生存环境的影响，其植物体内活性物质含量不同。

在16 种氨基酸中包含7 种人体必需氨基酸，含量为13.86～29.48 mg/g，与氨基酸总量（TFAA）的百分比介于39.58%～47.49%之间，与非必需氨基酸含量的百分比介于65.52%～90.44%之间。根据2007年WHO/FAO中规定必需氨基酸/总氨基酸、必需氨基酸/非必需氨基酸二者比值其理想模型为40%和60%，我们可知，福建漳州平和县和广西钦州灵山县的五指毛桃最接近理想模型，可考虑将两个产地的五指毛桃作为氨基酸补充剂进行开发。

研究发现，L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸等9 种为药用氨基酸，本研究的测定结果表明，12 份五指毛桃根中药用氨基酸含量为18.09～42.01 mg/g，12 份五指毛桃根中药用氨基酸占氨基酸总量介于51.65%～59.61%之间，其中，广西钦州灵山县五指毛桃根中药用氨基酸含量最高，而9 个地区五指毛桃根中药用氨基酸与总氨基酸比值差异不大，均高于50%，因此，这几个产区的五指毛桃均可提取药用氨基酸并推广利用。

3 结论

本文构建了异硫氰酸苯酯-柱前衍生HPLC 法同时测定不同叶形、不同产地12 批五指毛桃根中16 种氨基酸含量的方法，该方法能使16 种氨基酸有效分离，且线性关系良好，检出限为0.364～1.052 ng/mL，定量限为1.394～4.207 ng/mL，平均加样回收率在98.1%～105.9%，RSD 为0.67%～2.11%。由以上结果可以看出该方法精密度高、稳定性和重复性均良好，可作为五指毛桃根中氨基酸含量的测定方法，为完善其质量标准提供了科学依据。