响应面法优化茴香精油提取工艺及其微乳特性和货架期研究

韩 冰，张天琪，郑 野，韩 雪，姜晓涵，韩春然，张根生，遇世友

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150028）

茴香（Mill.），伞形科茴香属，具有调味、温肾及暖肝等多种功效。茴香精油是茴香的主要成分之一，主要由茴香脑、单萜类及脂肪酸等有机化合物组成，具有抗氧化、抑菌及杀虫等功效。但因其水溶性低、热稳定差且易挥发等弊端，大大降低了茴香精油的应用范围。目前，微胶囊技术是提高茴香精油稳定性的主要手段，但由于微胶囊的制备存在工艺繁琐、成本较高、联动化生产受限等多种原因，限制了其在食品领域的应用。因此，迫切需要一种合适的手段改善茴香精油的溶解性，提高茴香精油的稳定性和生物活性。

微乳液是一种由水相、油相、表面活性剂及助表面活性剂在适合的比例下自发形成的一种油水混合物体系，由于具有良好的稳定性，制作工艺简单，且能够保护生物活性及提高包埋物生物利用度等优点，使其在工业、食品、医药等领域被广泛应用。据报道，Laothaweerungsawat 等探究可知大麦精油微乳对香芹酚具有良好的增溶效果和保护作用。汤友军等通过三元相图法制得柑橘精油微乳液，并对其部分特性进行分析，结果表明，Tween 80 与Tween 40 复配（1:1）作为表面活性剂，正丁醇为助表面活性剂，去离子水为水相时，柑橘精油微乳稳定性最好，对DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力良好。因此，可知微乳体系对于精油类物质有很好的增容效果，能显著提升脂溶性物质的生物利用度，具有很高的实用价值。

目前，国内外关于茴香精油的研究较多，而关于茴香精油微乳结构和性质的研究却未见报导。本文对茴香精油提取工艺进行优化，构建微乳体系包埋茴香精油，并对其结构、特性和货架期进行相关研究，为今后茴香精油及其微乳在食品行业的发展应用提供相应参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小茴香 铜川市恒润食品有限公司；无水乙醇、丙酮、石油醚 分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；乙酸乙酯 分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司；Tween 80、Tween 40 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；丙三醇 食品级，天津市致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 分析纯，天津市化学试剂一厂；硫代硫酸钠 分析纯，科密欧化学试剂有限公司；其他化学药品和试剂均为分析纯，商购可得。

800A 型中草药粉碎机 天津市太斯特仪器有限公司；B-012511 型索氏提取器 郑州东亚玻璃仪器厂；SHB-4 型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司；ALC-2100.2 型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；GB/T6003.1-1997 型标准检验筛 浙江上虞市风华五金仪器有限公司；HH-511 型电热恒温水浴锅 海跃进医疗器械厂；NDJ-1 型流变仪 美国博勒飞公司；DHP-9052 型恒温培养箱 苏州江东精密科学仪器有限公司；Alpha－1506 型紫外可见分光光度计 上海光谱有限公司；马尔文激光粒度仪英国马尔文仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茴香精油提取工艺 取小茴香10 g 将其烘干后用粉碎机粉碎并分别过40～120 目筛，将过筛后的少量茴香粉置于滤纸袋中，随后将其整体放置于索式提取管内，加入一定量无水乙醇，进行加热回流提取，提取完成后将提取物在40 ℃下用旋转蒸发仪蒸发，去除溶剂后在残留物质中加入50 mL 蒸馏水和乙醚进行萃取，并将萃取完成后的有机相转入整流装置，通过蒸馏去除乙醚，制得小茴香精油。

1.2.2 单因素实验 固定条件为：取60 目的茴香粉末10 g，料液比1:8，浸提溶剂无水乙醇，浸提温度80 ℃，浸提时间4 h。再分别考察浸提溶剂（无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷及丙酮）、料液比（1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10 g/mL）、浸提时间（1、2、3、4、5、6 h）、浸提温度（70、75、80、85、90 ℃）、颗粒粒度（40、60、80、100、120 目）等因素对茴香精油得率的影响。

1.2.3 响应面优化试验 通过单因素实验进行优选，确定料液比（A），浸提时间（B），粒度（C）作为响应系数，茴香精油得率（Y）作为响应值。根据Box-Behnken 实验原理，进行了设计实验、显着性检验和实验结果的线性分析。试验因子水平设计表如表1所示。

表1 响应面因素水平表Table 1 Response surface factor level table

1.2.4 茴香精油得率的计算

1.2.5 茴香精油微乳制备工艺 参考Corswant 等方法并稍作修改。准确称量4:2 的混合表面活性剂（Tween 80:Tween 40=1:1）和助表面活性剂（丙三醇），混匀作为混合乳化剂备用。再将混合乳化剂和茴香精油按照4:1 的比例在室温下以1000 r/min 的转速磁力搅拌1 h，搅拌过程中，逐滴缓慢加入去离子水，直至体系由澄清变浑浊或由浑浊变澄清，此后若继续滴加去离子水，状态无任何变化，即形成微乳液。

1.2.6 茴香精油微乳的性质测定

1.2.6.1 构型的测定 按照Tween 80+40（Tween 80:Tween 40=1:1）/丙三醇/茴香精油=4:2:1.5 的比例，制备水相含量为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的茴香精油微乳。将样品放在距离4 cm 平板0.5 mm 处，采用流变仪在取样数50，间隔6 s 的条件下，测定不同含水量的茴香精油微乳液在不同剪切速率下（0～100 s）的黏度变化。

1.2.6.2 粒径的测定 采用马尔文激光粒度仪于波长659 nm、温度25 ℃、散射角90°的条件下，测定茴香精油微乳粒径大小。

1.2.6.3 总还原力的测定 分别取不同浓度的茴香精油乙醇溶液及其微乳乙醇溶液2 mL，分别加入磷酸盐缓冲液和铁氰化钾，50 ℃下恒温水浴锅反应2 min，立即取出并添加2 mL 三氯乙酸，在3000 r/min下离心10 min，取上清液依次添加蒸馏水和三氯化铁溶液，移至50 ℃下恒温水浴锅，反应10 min，测定吸光值，还原力的大小用吸光度表示。

1.2.7 茴香精油微乳货架期

1.2.7.1 贮藏温度对茴香精油微乳过氧化值影响将茴香精油及其微乳液分别置于20、35、50 和65 ℃的恒温培养箱内贮藏，测定48、96、144、192 和240 h时的过氧化值，探讨贮藏温度对茴香精油及其微乳液过氧化值的影响，按GB 5009.227-2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中的方法测定过氧化值。

1.2.7.2 茴香精油微乳贮藏期模型建立 根据化学反应动力学原理，茴香精油微乳不同温度下POV值，分别与动力学方程C=C-kt 和lnC=C-kt 进行拟合（C 为POV 值；C为样品初始POV 值），通过比较反应回归系数（），确定反应速率k，然后通过Arrhenius 方程，即可推导出茴香精油微乳氧化动力学模型，Arrhenius 方程如下：

式中：k为方程值前因子；E为活化能，kJ/mol；R 为8.314 J/（mol·K）；T 为热力学温度，K。

对上述公式两边同时取对数可得：

式中：lnk 与1/T 呈正相关，-E/R 为斜率，lnk为常数项，k 为反应速率常数，对k 进行线性拟合，即可确定E和k，进而确定茴香精油微乳氧化动力学模型。

1.2.7.3 茴香精油微乳货架期预测 以1.2.7.1 和1.2.7.2 为基础，采用茴香精油微乳氧化动力学模型，推导出不同温度下的反应速率常数k，再根据以上公式即可预测出茴香精油微乳的货架期。

式中：A 为POV 值，g/100 g；A为样品初始POV 值，g/100 g；K 为氧化反应速率常数；t 为贮藏时间, h。

1.3 数据处理

采用Excle 2010、Origin2018 作图，Design-Expert（Version 8.0）进行响应面分析，SPSS（Version 17.0）进行统计学分析，＜0.05 认为有统计学显著性差异，＜0.01 认为有统计学极显著性差异，平行实验3 次。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 浸提溶剂对茴香精油得率的影响 由图1 可知，当浸提溶剂为无水乙醇时，茴香精油得率显著高于（＜0.05）石油醚、乙酸乙酯、丙酮和正乙烷浸提组，此时制得的茴香精油颜色呈深绿色，具有天然茴香风味，这可能因为无水乙醇是插入界面膜的乳化剂，进而降低界面膜的表面张力，增加体系的稳定性和流动性，促进界面膜的伸张和弯曲，这与李琴等的研究结果相似。

图1 浸提溶剂对茴香精油得率的影响Fig.1 Effect of solvent extraction on the yield of fennel essential oil

2.1.2 料液比对茴香精油得率的影响 由图2 可知，随着料液比的提高，茴香精油得率呈先上升后下降的趋势，且当料液比为1:8 g/mL 时，茴香精油得率最大。这可能由于当乙醇添加量过少时，茴香颗粒在溶剂中无法分散均匀，不能充分溶出；而乙醇添加量过多时，后续长时间减压蒸馏浓缩，降低茴香精油得率。

图2 料液比对茴香精油得率的影响Fig.2 Effect of material to liquid ratio on yield of fennel essential oil

2.1.3 浸提时间对茴香精油得率的影响 由图3 可知，茴香精油得率随着浸提时间的增加，呈现先升高后趋于稳定的趋势，当浸提时间为4 h 时，茴香精油得率高达14.99%。这是由于浸提初期，浸提时间延长促进茴香精油的充分溶出，当浸提时间为4 h 时，茴香精油溶液趋于饱和，此后，随着浸提时间的延长，反而可能会导致少量茴香精油的挥发损失。

图3 浸提时间对茴香精油得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of fennel essential oil

2.1.4 颗粒粒度对茴香精油得率的影响 由图4 可知，茴香精油得率随着颗粒粒度的减小，呈先快速上升后下降的趋势，当茴香粒度为80 目时，茴香精油得率高达15.76%，这可能由于，茴香颗粒粒度越小，与浸提溶剂接触表面积越大，浸提更充分，提高了茴香精油的得率。但颗粒粒度过低时，颗粒间吸附力增强，反而导致溶剂在颗粒间和颗粒内扩散度变小。

图4 颗粒粒度对茴香精油得率的影响Fig.4 Effect of particle size on yield of fennel essential oil

2.1.5 浸提温度对茴香精油得率的影响 由图5 可知，茴香精油得率随浸提温度的升高呈先上升后平缓的趋势，这可能是由于当浸提温度低于乙醇沸点（78 ℃）时，4 h 的浸提过程中仅发生一次虹吸，严重降低了茴香精油的提取效率。当浸提温度高于乙醇沸点时，浸提较为充分，茴香精油得率无显著差异（＞0.05）。因此，浸提温度不作为后续响应面试验的响应因素，且将后续实验浸提温度设定为80 ℃。

图5 浸提温度对茴香精油得率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of fennel essential oil

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果分析 响应曲面试验共完成三因素三水平共17 组试验，其中12 个为试验分析点，另外5 个为试验中心点，用以检验试验误差。试验结果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 试验设计Table 2 Experimental scheme of Box-Behnken design

通过Design Expert 对表2 数据进行分析，得到关于茴香精油得率（Y）的二次回归方参数模型及显著性检验数据，结果如表3 所示。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of regression equation

由表3 可知，模型的值为66.45，值为0.0001＜0.01。二次方程模型之间的差异极显著，模型与响应值拟合得非常好。决定系数=0.9884，校正决定系数=0.9736，说明该模型能反映响应值的变化，可用于分析和预测茴香精油的制备工艺。失拟项为2.45，=0.2036＞0.05，说明模型是稳定的。此外，AC 的值为0.0012 小于BC 的值0.0073，所以交互作用显著性从大到小依次为AC＞BC＞AB。同时，一次项中A、B 显著（＜0.05），二次项极显著（＜0.01），交互项AB 不显著（＞0.05），三个因素精油得率影响大小的顺序为料液比（A）＞浸提时间（B）＞颗粒粒度（C）。综上，各种因素对茴香精油得率的影响不是简单的线性关系，回归方程如下：

2.2.2 交互作用分析 通过曲面图判断因素之间相互作用是否显著，表面曲率和颜色深浅与显著性也正相关。且等高图形状椭圆明显也说明交互作用越显著。由图6、图7 可知，料液比（A）、浸提时间（B）、颗粒粒度（C）任意两因素交互时，当交互作用中某一因素水平上升时，另一因素水平同时上升，导致响应值随之变化。料液比（A）和浸提时间（B）的轮廓是圆形的，两因素的相互作用不显著，颗粒粒度（C）与料液比（A）、浸提时间（B）与颗粒粒度（C）为椭圆形，并且响应曲面图的斜率很陡，表明两者之间的相互作用极显著。

图6 料液比与颗粒粒度交互作用图Fig.6 The interaction diagram of solid-liquid ratio and particle size

图7 浸提时间与颗粒粒度交互作用图Fig.7 The interaction diagram of extraction time and particle size

2.2.3 最优工艺确定与验证 根据Design Expert 8.0.6 软件分析，当料液比为1:8.4 g/mL，浸提时间为4.09 h，颗粒粒度为78.99目时，模型预测值为16.09%，茴香精油得率最高。为验证结果，从而得到茴香精油最优的提取条件。考虑实验可操作情况，调整提取条件为：料液比1:8.4 g/mL、浸提时间为4.09 h、颗粒粒度80 目，在此条件下提取3 次，平均得率为15.99%，该结果仅与模型预测值存在0.10%误差，说明该模型可靠。

2.3 茴香精油微乳性质探究

2.3.1 茴香精油微乳的构型 黏度是微乳重要的物理指标参数，微乳属于牛顿流体，其微观结构影响宏观黏度。采用流变仪测定不同剪切速率下，茴香精油微乳的水相占比与黏度之间的关系，进一步分析该微乳体系相转变行为。由图8 可知，剪切速率小于25 s时，黏度不稳定。随剪切速率的增大，微乳黏度变化不明显，最后趋于稳定的牛顿流体。为方便直观的判断茴香精油微乳黏度变化与水相占比的关系，需在60～80 s范围内选择剪切速率，设定为65 s，研究茴香精油微乳的水相占比与黏度之间的关系，结果见图9。由图9 可知，茴香精油微乳体系内的黏度随水分含量的增加呈先上升后下降的趋势，此过程可能伴有微乳类型转化的过程。这和墙梦婕对艾叶精油微乳类型转化的研究一致。当水分低于50%时，随着水分的增加，体系内颗粒体积变大，分子间作用力增大，聚集密切，此时为W/O 型微乳。当水分占比从50%增至60%的过程中，黏度上升速度最快，水分占比为60%时黏度有最大值，此阶段微乳为连续性微乳，60%为连续性微乳与O/W 型微乳的临界点，水分超过60%，水不断稀释茴香精油微乳，分子间作用力减小，黏度也随之减小，微乳不断接近水的黏度，此时微乳为O/W 型。

图8 不同剪切速率下不同含水量微乳黏度Fig.8 The viscosity of microemulsion with different water content under different shear rate

图9 65 s-1 剪切速率下不同含水量微乳黏度Fig.9 Microemulsion viscosities with different water content at 65 s-1 shear rate

2.3.2 茴香精油微乳粒径的测定 以茴香精油为油相、Tween 80+40（Tween 80:Tween 40=1:1）为混合表面活性剂、丙三醇为助表面活性剂制备茴香精油微乳。经马尔文激光粒度仪测得微乳粒径为30.92±0.13 nm，PDI 值为0.27±0.02。

粒径和多分散指数（PDI）是考察微乳特性的重要指标，PDI 值越小粒径越符合正态分布，微乳体系越稳定。由图10 可得，茴香微乳液的粒径范围值在10～100 nm 之间，且PDI 值较小、外观均呈现澄清透明的状态，同时，张宇航等对刺五加总苷微乳粒径研究发现，当粒径为26.47±0.04 nm，PDI 为0.118±0.03 时，刺五加总苷微乳具有良好的稳定性，因此，微乳体系可以有效提高茴香精油的稳定性，是茴香精油的优良载体。

图10 茴香精油微乳粒径分布图Fig.10 Distribution of particle size of fennel essential oil microemulsion

2.3.3 茴香精油微乳总还原力测定 吸光值与总还原力呈正比，总还原力的大小代表抗氧化能力的高低，是评价茴香精油及其微乳液抗氧化活性的重要指标。由图11 可知，随着茴香精油质量浓度的增加，茴香精油及其微乳的总还原力呈先快速上升后趋于平稳的趋势，茴香精油浓度为5 mg/mL 时，两者的还原力达到最优，吸光值分别为0.52、0.58，这是因为微乳体系作为载体能够有效保护茴香精油中的活性物质不被破坏，使其均匀分布在微乳体系内，增加活性成分的作用效果。这与Mostafa 等研究微乳液对植物营养素抗氧化性的研究结果一致。

图11 茴香精油及微乳液的总还原力Fig.11 Total reducing power of fennel essential oil and microemulsion

2.4 茴香精油微乳货架期

2.4.1 贮藏温度对茴香精油微乳抗氧化影响 由图12可知，温度对茴香精油微乳及茴香精油的POV 值影响较大，温度越高，茴香精油微乳和茴香精油的货架期越短，且茴香精油微乳的抗氧化性要优于茴香精油，这是因为随着温度的升高，表面活性剂中氢键与水结合并断裂，导致液界膜受到破坏，使茴香精油与氧气接触面增大。这与易醒等对紫苏子油微乳氧化稳定性的研究结果一致。

图12 茴香精油微乳及茴香精油过氧化值随贮藏时间的变化Fig.12 Changes in peroxide value of fennel essential oil microemulsion and fennel essential oil with storage time注：a：茴香精油微乳；b：茴香精油。

2.4.2 茴香精油微乳货架期模型建立 为了探究茴香精油微乳液与温度之间的关系，分别用零级反应动力学方程（C=C-kt）和一级反应动力学方程（lnC=C-kt），对茴香精油微乳液在各贮藏温度下的POV 值进行拟合，结果如表4 所示。

反应回归系数是判定反应拟合哪种动力学模型的标准，由表4 可以看出，在相同温度下，一级反应动力学方程的回归系数均大于零级反应动力学方程，且均大于0.97，说明茴香精油微乳液的氧化反应可以拟合一级反应动力学方程。

表4 茴香精油微乳在不同储藏温度下的反应动力学方程Table 4 The reaction kinetics equation of fennel essential oil microemulsion at different storage temperatures

由图13 可知，-E/R=-4297.9、lnk=7.8551，=0.989，说明lnk 与1/T 的线性关系良好。经计算，E=35583.09，k=2578.85，此时氧化反应速率常数k 与贮藏温度（T）之间的Arrhenius 方程为：k=2518.85·。

图13 反应速率常数与贮藏温度的线性回归分析Fig.13 Linear regression analysis of reaction rate constant and storage temperature

2.4.4 茴香精油微乳理论货架期预测及验证 GB2716-2018《食品安全国家标准 植物油》中规定，当植物油脂过氧化值超过0.25 g/100 g 即为变质，由茴香精油微乳液氧化动力学模型，能计算出不同贮藏温度下反应速率常数k，与将测得的POV 值初始值A=0.0272 g/100 g，代入公式A =Ae中，即可预测出不同贮藏温度下茴香精油微乳液的货架期理论值，同时，为验证该模型准确性，对不同温度下茴香精油微乳货架期的预测值与实测值进行比较，如表5 所示。

由表5 可知，本研究建立的茴香精油微乳体系货架期模型预测值最大误差为8.73%，误差较小，证实在20～65 ℃下可用该模型预测茴香精油微乳的货架期。由茴香精油及其微乳的货架期实测值可知，微乳体系能够有效提高茴香精油的氧化稳定性。

表5 不同贮藏温度下茴香精油微乳液的货架期预测值和实测值Table 5 Shelf life predicted and measured value of fennel essential oil microemulsion at different storage temperatures

3 结论

本研究通过单因素实验和响应面试验，确定茴香精油最优提取工艺为：料液比1:8.4 g/mL，浸提时间4.09 h，颗粒粒度80 目，浸提温度80 ℃。在此条件下，在以茴香精油为油相，Tween 80+40（Tween 80:Tween 40=1:1）为混合表面活性剂，丙三醇为助表面活性剂制备茴香精油微乳。最后，采用流变法、马尔文激光粒度仪、体外实验及加速实验对该微乳的构型、粒径、抗氧化性及贮藏期进行探究。结果表明，茴香精油微乳粒径为30.92±0.13 nm，当微乳体系水分含量小于50%时，为W/O 型微乳，水分继续上升转化为双连续型微乳，水分含量大于60%时，为O/W 型微乳，溶解在微乳体系的茴香精油抗氧化性得到明显提高，在一级反应动力学方程（lnC=C-kt）基础上，建立Arrhenius 方程为：k=2518.85·e，可测得茴香精油微乳在20 ℃下，货架期约为79.13 d。本研究研制的茴香精油微乳操作简单，状态稳定，是一种天然绿色的新型保鲜剂，这对茴香精油的潜在应用与开发具有指导意义。