西瓜新炭疽病菌的鉴定、生物学特性及药剂敏感性研究

靳俊媛，王友贤，刘 倩，孙 蕾，白庆荣，赵廷昌

（1.吉林农业大学植物保护学院 长春 130118； 2.吉林省蛟河市农业综合行政执法大队 吉林蛟河 132500；3.黑水镇综合服务中心（农业技术推广站） 吉林洮南 137101； 4.中国农业科学院植物保护研究所 北京 100096）

西瓜（L.）是一年生蔓生草本植物，其果肉味甜，能降温去暑；种子含油，可作消遣食品；果皮药用，有清热、利尿、降血压之效，在我国各地均有栽培。吉林省中西部地区常年种植西瓜，种植面积约4002 hm，西瓜产业不仅是吉林省农村脱贫致富的重要产业之一，也在2018 年被列为吉林省乡村振兴战略规划中的优势特色产业之一。在生长过程中，西瓜会遭受到多种病原菌的危害。其中，炭疽病是西瓜生产上最严重的病害之一，且有逐年加重的趋势，该病害会造成植株提早枯死，西瓜的产量和品质下降，使瓜农蒙受严重的损失。目前，国内外学者普遍认为西瓜炭疽病多由引起，2018 年黄蔚等从湘西民族职业技术学院科技园种植的感染炭疽病的西瓜病叶上分离出胶孢炭疽菌。2018—2021 年，笔者对吉林省西瓜主产区疑似感染西瓜炭疽病的病株进行采集，在分离和鉴定过程中发现了一些与菌落形态不同的分离物，且在采集的样品中占有一定的比例。笔者进一步对所获得的分离物进行了致病性测定、形态学特征观察及系统发育分析，确认该病原菌为菜豆炭疽菌，并对该病原菌的生物学特性及药剂敏感性进行了相关研究。该研究为防控引起的西瓜炭疽病提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害标本的采集与症状观察

2018 年7 月至2021 年9 月对吉林省及周边西瓜主产区（乾安县、长岭县、双辽市、内蒙古科尔沁左翼中旗）西瓜炭疽病的病样进行采集，调查并拍照记录病害的危害情况，部分样品用于病原菌的分离，其余部分样品制作腊叶标本保存于吉林农业大学植物病理教研室。

1.2 病原菌的分离与纯化

用无菌剪刀剪取样品病健交界处4 mm×4 mm组织块若干，置于75%乙醇溶液中浸泡消毒1 min后，用无菌水浸泡30 s，3 次重复。风干2.5 h 后，将组织块放置于PDA 培养基上，在25 ℃恒温培养箱内进行培养。用无菌接种铲在菌落边缘铲起4 mm×4 mm 菌块，继续培养。纯化后取菌丝块置于预先做好的PDA 斜面培养基上，放置在4 ℃冰箱内保存备用。

1.3 病原菌致病性测定

选择纯化后代表菌株Y 6-1，在PDA 上培养20 d 后，使用无菌水制作1×10个·mL的孢子悬浮液。在温室内采用常规喷雾法将孢子悬浮液接种到10 株健康的西瓜（蜜红198，黑龙江全福种苗有限公司）幼苗上，对照植株喷无菌水。塑料袋保湿3 d，每天观察记录植株发病情况。采集发病部位进行病原菌分离，若分离到与原始接种物相同的分离物，则证明分离物是致病病原菌。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.2 病原菌的分子生物学鉴定 采用CTAB 法从新鲜菌丝中提取基因组总DNA。以提取出的总DNA 为模板，进行特异性扩增，扩增反应体系（25.0 μL 体系）：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL；酶0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，ddHO 17.0 μL。选择引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R、CHS-354R/CHS-79F 和GDF1/GDR1 分别对核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、肌动蛋白基因（，）、几丁质合成酶A 基因（，）和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（，）进行PCR 扩增，所有产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，随后委托上海生工公司完成测序。

将所得的序列上传至GenBank，并与Gen-Bank 核酸数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中的相关序列进行同源性比较。通过PAUP*（Phlogenetic Analsis Using Parsimon）v. 4.0b10（Swofford 2003）软件中的最大简约法（Maximum Parsimony，MP）构建多基因联合系统发育树对其分类地位进行确认。

1.5 病原菌生物学特性测定

1.5.1 不同培养基对病原菌菌丝生长及产孢的影响 10种培养基的制备方法如下：燕麦琼脂培养基（Oatmeal Agar，OA）：燕麦片20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL；西瓜果皮煎汁琼脂培养基（Watermelon peel Decoction Agar，WDA）：西瓜皮100 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL；水琼脂培养基（Water Agar，WA）：琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；番茄燕麦琼脂培养基（Tomato Oat Agar，TOA）：番茄200 g，燕麦片30 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；胡萝卜琼脂培养基（Carrot Agar，CA）：胡萝卜100 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；西瓜果肉煎汁琼脂培养基（Watermelon pulp Decoction Agar，WPA）：西瓜果肉200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；马铃薯蔗糖琼脂培养基（Potato Sucrose Agar，PSA）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；玉米粉琼脂培养基（Cornmeal Agar，CMA）：玉米粉40 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL；马铃薯胡萝卜琼脂培养基（Potato Carrot Agar，PCA）马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL。

选用10 种不同的固体培养基，每个培养皿中注入15 mL 培养基，将直径为6 mm 的菌饼放置在培养基的中央，2 次重复，置于25 ℃培养箱中黑暗培养。7 d 后采用十字交叉法测量菌落的直径，20 d 后用血球计数板测定产孢量，使用Excel 2016 软件对试验数据进行统计分析，IBM SPSS Statistics 22 软件进行单因素方差分析比较差异显著性。

1.5.2 不同pH 值对病原菌菌丝生长及产孢的影响 以PDA 为基础培养基，用HCl（1 mol·L）和NaOH（1 mol·L）将PDA 的pH 值调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0。病 原 菌 培 养 方 法 同1.5.1。

1.5.3 不同氮源对病原菌菌丝生长及产孢的影响 以查氏培养基为基础培养基，分别用等量的L-丙氨酸、L-赖氨酸、蛋白胨、甘氨酸、磷酸二氢铵、L-胱氨酸、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、尿素替换硝酸钠。后续试验操作同1.5.1。

对原始放电声库进行预处理,使得数据库由3种状态(电晕状态、击穿状态和正常状态)声音组成,每组150个样本,共450个样本。所有样本均进行了标注和裁剪,以适合算法使用。其中,每组抽出30个用于测试,余下120个用于训练。故训练样本共360个,测试样本共90个。每个样本长度为3 s等长。为充分利用实验数据,这里采用K交叉验证方法对实验数据进行验证,K值取5,即数据库被分成5份,每一份的数据容量为90个。

1.5.4 不同碳源对病原菌菌丝生长及产孢的影响 以查氏培养基为基础培养基，分别用等量的葡萄糖、可溶性淀粉、D-麦芽糖、D-果糖、木糖醇、木糖、山梨醇、D-甘露醇、乳糖代替蔗糖。后续试验操作同1.5.1。

1.5.5 不同温度对病原菌菌丝生长及产孢的影响 将培养温度设为4、10、15、20、25、30、35 ℃，后续试验操作同1.5.1。

1.5.6 不同光照条件对病原菌菌丝生长及产孢的影响 将光照条件设为全光照、12 h 光照/12 h 黑暗、全黑暗条件下培养，后续试验操作同1.5.1。

1.6 病原菌药剂敏感性测定

供试菌株：西瓜炭疽病病原菌的代表菌株Y 6-1。供试药剂：50%多菌灵可湿性粉剂（江苏蓝丰生物股份有限公司），25%嘧菌酯悬浮剂（山东青岛海利尔药业集团股份有限公司），22.5%啶氧菌酯悬浮剂（美国杜邦公司），75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、35%氟菌·戊唑醇悬浮剂[拜耳作物科学（中国）有限公司]，250 g·L苯醚甲环唑乳油、560 g·L嘧菌·百菌清悬浮剂、350 g·L苯甲·嘧菌酯悬浮剂（瑞士先正达作物保护有限公司），75%百菌清可湿性粉剂（先正达南通作物保护有限公司），60%唑醚·代森联水分散粒剂（杭州宇龙化工有限公司），12%氟菌·氟环唑乳油、42.4%唑醚·氟酰胺悬浮剂[巴斯夫植物保护（江苏）有限公司]，500 g·L异菌脲悬浮剂（苏州富美实植物保护剂有限公司），500 g·L甲基硫菌灵悬浮剂、40%双胍三辛烷基苯磺酸盐可湿性粉剂（江苏龙灯化学有限公司），80%克菌丹水分散粒剂（安道麦马克西姆有限公司），40%嘧菌·戊唑醇悬浮剂（江门植保有限公司），25%吡唑醚菌酯悬浮剂（石家庄市深泰化工有限公司）。

采用菌丝生长速率法测定菌丝对不同药剂的敏感性。将每个药剂制成含药1×10、1×10、1、1×10、1×10、1×10mg·L的PDA 平板，3 次重复，每次重复1 个平板，对照组用等量无菌水。取直径6 mm 的菌饼，放置于含药平板上，25 ℃黑暗培养。当对照组菌落直径长至40～50 mm 时，采用十字交叉法测量菌落直径并记录。

菌丝生长抑制率/%=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼原始直径）×100。

孢子萌发法测定孢子对不同药剂的敏感性。含药平板制作方法同上，但用OA 代替PDA，制作含1×10个·mL的孢子悬浮液，取100 μL 用涂布器均匀涂布在OA 平面上，平板于25 ℃黑暗培养，以对照组萌发90%左右作为标准，每个处理观察300 个孢子，计算孢子萌发抑制率。

孢子萌发抑制率（%）=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100。

利用VBA 程序建立药剂浓度的对数值与菌丝生长抑制率（孢子萌发抑制率）对应的概率值之间的回归方程ab，求算有效抑制中浓度（EC）值。比较病原菌对各种药剂的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 病害症状

被侵染的西瓜叶片初期出现近圆形水渍状凹陷的黄褐色病斑，中心为黑色，后期病斑扩大变为褐色至黑色，中部有白色坏死区域，严重时病斑中间开裂。瓜蔓初期发病症状与叶片上的发病症状一致，后期变成长条形的深紫色或黑色的病斑（图1）。

图1 西瓜炭疽病自然发病症状

2.2 病原菌的分离与纯化

从吉林省西瓜主产区采集的西瓜炭疽病病株上分离纯化得到菌株52 株菌落形态基本一致的分离物，具体分离地点及数量见表1。

表1 病害样品采集时间与地点

2.3 分离物致病性测定

从图2 可以看出，接种7 d 后，接种的西瓜叶的发病症状与田间一致，且对照植株不发病，因此可以确定该分离物具有致病性。

图2 菌株Y 6-1 致病性测定

2.4 病原菌的鉴定

2.4.1 病原菌的形态特征 从图3 可以看出，Y 6-1菌株生长初期菌丝为白色或浅灰色，随着菌丝增多，逐渐覆盖整个培养皿，后期气生菌丝变少，菌落整体转变为黑灰色，外缘菌丝为白灰色，菌落表面及培养基内部产生大量黑色颗粒，即分生孢子盘。Y 6-1 菌株在PDA 上分生孢子产生数量较少，分生孢子为单胞，无颜色，长弯月形，孢子大小为（20.73～24.72）μm×（3.25～3.74）μm，（图3-D、E）。分生孢子盘为灰黑色，球形（图3-F），查阅相关文献进行对比发现，该病原菌与炭疽菌的形态特征极为相似。

图3 Y6-1 菌株的形态特征

2.4.2 病原菌的分子生物学鉴定 系统发育树菌株信息如表2所示，以Y 6-1 菌株基因组DNA 为模板，将以ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R、CHS-354R/CHS-79F、GDF1/GDR1 为引物扩增的基因序列登录号分别命名为MN880260、ON189039、ON189040和ON189041。基于、、与多基因联合构建系统发育树，结果表明：致病菌Y6-1与归于一个分支，且Bootstrap 支持率为100%（如图4），进一步确定致病菌为。

图4 由Y 6-1 菌株ITS、ACT、CHS-1 和GAPDH 基因串联序列构建的系统发育树

表2 系统发育树中使用的菌株信息

2.5 病原菌生物学特性

2.5.1 不同培养基对病原菌生长及产孢的影响由图5 可以看出，菌株Y 6-1 在10 种培养基上均能生长与产孢。菌丝在PDA 培养基上生长最快，但与其在PSA 上的生长速度没有显著差异，在WA 上生长最慢，显著小于在其他培养基上的生长速度。病原菌在CMA 上产孢最多，与在PSA 和WPA 上的产孢量无显著差异；在PCA 上产孢最少，与在PDA、WDA、WA、OA 和CA 上的产孢量无显著差异。菌丝生长最佳培养基为PDA，产孢最佳培养基为CMA。

图5 不同培养基对C.incanumY 6-1 菌株菌丝生长和产孢的影响

2.5.2 不同pH 值对病原菌生长及产孢的影响 由图6可以看出，菌株Y 6-1 在试验pH 值条件下均能生长与产孢。菌丝在pH 值为5、8 和10 条件下生长速度较快，但差异不显著；菌丝在pH 值为6～10条件下生长差异不显著，pH 值为5 时菌丝生长最快，pH 值为11 时菌丝生长最慢。病原菌在pH 值为5 时产孢最多，与其他pH 培养基差异显著，在pH 值为10 和11 时产孢量显著降低，在pH 值为6～9 时产孢量显著低于其他条件下的产孢量，在pH值为7 时产孢量最少，菌丝生长和产孢最佳pH 值均为5。

图6 不同pH 值对C.incanumY 6-1 菌株菌丝生长和产孢的影响

2.5.3 不同氮源对病原菌生长及产孢的影响 由图7 可以看出，Y 6-1 菌株在10 种不同氮源的培养基上均能生长。在以甘氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸为氮源的培养基上，Y 6-1 菌株菌丝生长无显著差异，在甘氨酸培养基上生长最快，在硫酸铵培养基上生长最慢，且与其他培养基差异显著。病原菌在以甘氨酸为氮源的培养基上产孢最多，显著多于其他培养基，其次为以尿素为氮源的培养基；在磷酸二氢铵、硝酸铵和L-胱氨酸培养基上不产孢，其余培养基上产孢量均较少，无显著差异。因此，菌丝生长和产孢的最佳氮源均为甘氨酸。

图7 不同氮源对C.incanum Y 6-1 菌株菌丝生长和产孢的影响

2.5.4 不同碳源对病原菌生长及产孢的影响 由图8 可以看出，在9 种不同碳源的培养基上，Y 6-1菌株均能生长与产孢。在淀粉培养基上生长速度显著快于其他碳源培养基，其次为麦芽糖培养基，在木糖醇培养基上生长最慢，且显著慢于其他培养基。病原菌在麦芽糖培养基上产孢最多，显著优于其他培养基，在甘露醇上产孢最少，与在乳糖、木糖醇和山梨醇培养基上的产孢量无显著差异。因此，菌丝生长最佳碳源为淀粉，产孢最佳碳源为麦芽糖。

图8 不同碳源对C.incanum Y 6-1 菌株菌丝生长和产孢的影响

2.5.5 不同温度对病原菌生长及产孢的影响 由图9 可以看出，不同试验温度下Y 6-1 菌株均能生长，菌丝生长最佳温度为30 ℃，与其他温度下的生长速度差异显著，其次为25 ℃，在4 ℃中菌丝生长最慢，显著慢于其他培养温度。Y 6-1 在10 ℃产孢量最佳，与4 ℃、15 ℃和30 ℃相比，无显著差异；在25 ℃时产孢最少，除10 ℃外与其他温度均无显著差异。菌丝生长最佳温度为30 ℃，产孢最佳温度为10 ℃。

图9 不同温度对C.incanum Y 6-1 菌株菌丝生长和产孢的影响

2.5.6 不同光照对病原菌生长及产孢的影响 由图10 可以看出，Y 6-1 菌丝在全光照和半光照条件下生长最快，两者相比无显著差异，但均显著快于全黑暗条件下的生长速度。Y 6-1 的产孢量在不同光照条件下无显著差异，在全黑暗条件下产孢量最多。因此，Y 6-1 的菌丝生长最佳光照条件为全光照或半光照，产孢最佳光照条件为全黑暗。

图10 不同光照对C.incanum Y 6-1 菌株菌丝生长和产孢的影响

2.6 室内药剂敏感性测定

由表3 数据可知：Y 6-1 菌株的菌丝生长对50%多菌灵WP、42.4%唑醚·氟酰胺SC、75%肟菌·戊唑醇WG、25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、560 g·L嘧菌·百菌清SC 和40%嘧菌·戊唑醇SC 的敏感性较高，EC≤1 mg·L；对25%嘧菌酯SC、22.5%啶氧菌酯SC、35%氟菌·戊唑醇SC、12%氟菌·氟环唑EC 和80%克菌丹WG 的敏感性略低，1 mg·L＜EC＜10 mg·L；对500 g·L甲基硫菌灵SC、40%双胍三辛烷基苯磺酸盐WP 和500 g·L异菌脲SC 的敏感性较差，EC≥10 mg·L。

表3 西瓜炭疽菌Y 6-1 菌丝对杀菌剂的敏感性

由表4 数据可知：Y 6-1 菌株的孢子萌发对25%吡唑醚菌酯SC、560 g·L嘧菌·百菌清SC、60%唑醚代森联WG、40%双胍三辛烷基苯磺酸盐WP、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、500 g·L甲基硫菌灵SC、500 g·L异菌脲SC、40%嘧菌·戊唑醇SC 和35%氟菌·戊唑醇SC 的敏感性较高，EC≤1 mg·L；对12%氟菌·氟环唑EC、250 g·L苯醚甲环唑EC、22.5%啶氧菌酯SC 和25%嘧菌酯SC 的敏感性略低，1 mg·L＜EC＜10 mg·L；对75%百菌清WP 和50%多菌灵WP 的敏感性较差，EC≥10 mg·L。

表4 西瓜炭疽菌菌株Y 6-1 孢子萌发对杀菌剂的敏感性

综合Y 6-1 菌株菌丝和孢子萌发对药剂的敏感性测定结果可知，在菌丝生长和孢子萌发方面，其对25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、40%嘧菌·戊唑醇SC 和560 g·L嘧菌·百菌清SC 的敏感性较高，EC≤1 mg·L；对12%氟菌·氟环唑EC、22.5%啶氧菌酯SC、25%嘧菌酯SC 的敏感性略低，1 mg·L＜EC＜10 mg·L；在孢子萌发上，Y 6-1对40%双胍三辛烷基苯磺酸盐WP、500 g·L甲基硫菌灵SC 和500 g·L异菌脲SC 的敏感性较高，EC≤1 mg·L，但在菌丝生长方面对上述药剂敏感性较低，EC≥10 mg·L；病原菌菌丝生长 对 50% 多 菌 灵WP 敏 感 性 最 高，EC为0.006 5 mg·L，但其孢子萌发对多菌灵不敏感，EC为2 540.205 0 mg·L。

3 讨 论

Yang 等于2014 年在美国大豆叶柄和茎秆上发现并命名，并将其归为白蜡树炭疽菌复合种（species complex），在系统发育关系上显示其与同属、和的关系更近。笔者在本研究中发现菌株Y 6-1 的孢子、菌落和分生孢子盘等形态特征与相似，基因序列与在同一分支，与和亲缘关系较近，是首次从西瓜上分离得到。因此，西瓜为的新寄主。本研究在2018 年7 月至2021 年9 月分离得到52 株，占分离的西瓜炭疽菌菌株总数的10.86%（52/479），说明目前未形成优势种群。但在4 个县都有分布，应引起重视。本研究Y 6-1 的生物学特性与徐杉2017年在内蒙古自治区赤峰市的紫花苜蓿茎秆上分离得到的的生物学特性基本相同。

在药剂敏感性测定中，笔者发现50%多菌灵WP 对Y 6-1 菌丝生长抑制效果最佳（EC为0.006 5 mg·L），但对孢子萌发活性抑制最低（EC为2 540.205 0 mg·L），可以用于病害发生后的治疗；40%双胍三辛烷基苯磺酸盐WP、500 g·L甲基硫菌灵SC 和500 g·L异菌脲SC 对孢子萌发的效果较好（EC＜1.0 mg·L），但对菌丝生长抑制效果较差（EC＞10.0 mg·L），建议这类药剂在病害发生之前使用，用于病害的预防。本研究所得数据均为室内试验测定，药剂在田间的防治效果还有待进一步验证。

4 结 论

笔者对分离到的西瓜炭疽病新致病菌进行了形态学和分子生物学特征的研究，确定该致病菌为，进一步明确了Y 6-1 的生物学特性：菌丝生长的最适培养基为PDA，最适pH值为5，最适氮源为甘氨酸，最适碳源为淀粉，最适温度为30℃，全光照最适菌丝生长；产孢最适培养基为CMA，最适pH 值为5，最适氮源为甘氨酸，最适碳源为麦芽糖，最适温度为10 ℃，全黑暗条件下最适产孢。

药剂敏感性测定结果表明：病原菌菌丝生长和孢子萌发对25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、560 g·L嘧菌·百菌清SC、40%嘧菌·戊唑醇SC 的敏感性均较高；对25%嘧菌酯SC、22.5%啶氧菌酯SC 和12%氟菌·氟环唑EC 的敏感性略低。上述药剂均可作为该病害防治的药剂，建议多种药剂轮换使用，以延缓抗药性的产生。