基于SSR标记与化学成分构建十堰地区天师栗核心种质库＊

刘志格，叶利春，熊 超，刘义飞，郑国华，石召华，胡志刚，许 攀 ，施 川 ，4＊＊，张景景 ＊＊

（1. 湖北中医药大学药学院 武汉 430065；2. 武汉轻工大学生命科学与技术学院 武汉 430023；3. 武汉爱民制药股份有限公司 鄂州 436070；4. 湖北李时珍药物研究有限公司 鄂州 436070）

天师栗（Aesculus chinensisvar.wilsonii）是七叶树科七叶树属落叶乔木，主要产于河南西南部、湖北西部、四川东部等地[1]，是《中国药典》（2020 版）收载的中药材娑罗子的基原植物之一[2]。娑罗子具有疏肝理气，和胃止痛的功效，用于治疗肝胃气滞，胸腹胀闷，胃脘疼痛等。历代本草中记载其功效有《肘后备急方》、《药性考》等，主治心腹痛，宿食不消，胃脘胀痛、痈疽疔肿，解毒等[3-4]。现代药学研究表明其主要药用成分为七叶皂苷，具有抗炎、抗渗出、提高毛细血管的张力、加快静脉回流、改善血液循环等药理作用[5-8]，临床上常用于脑水肿、伤口肿胀及静脉回流障碍性疾病的治疗[9-14]，近年较多学者探索发现七叶皂苷钠对坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经性疼痛的改善[15]、治疗慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）合并肺心病心力衰竭改善患者肺功能[16]、对糖尿病大鼠心脏自主神经病变的减弱[17]等作用。已在国内外上市的七叶皂苷系列制剂如七叶皂苷钠冻干粉针剂、搽剂、复方凝胶、片剂、胶囊等剂型被广泛用于治疗心脑血管系统、软组织损伤和其他渗出性疾病，国外也开发用于缓解运动后肌肉局部酸痛的外用乳霜[18]等。随着上述产品临床应用范围和市场规模的扩大，市场对娑罗子中药材需求量逐年上涨。目前娑罗子药材多为野生资源，极少量为引种栽培，由于缺乏系统的种质资源保护和规范化种植技术研究，引种混乱，导致药材基原混乱，导致娑罗子药材品质良莠不齐，伪品掺杂使用常见，无法满足监管法规要求及市场需求。

随着现代科学技术和理论的快速发展，对药品的监管日趋科学和严谨，要求固定其基原、产地等，以保证原料质量稳定[19]。据《本草纲目》记载，十堰所产娑罗子即是宋代《益部方物略记》中记载的天师栗，表明十堰地区为天师栗道地产区之一[20]，国内已有学者对娑罗子药材资源开展了品质评价等研究，湖北十堰地区的娑罗子品质优良[21]。但还未见有报道基于分子标记结合化学成分筛选娑罗子优良种质的研究，在道地产区筛选优良的种质资源，构建天师栗的核心种质库，筛选出优良的天师栗种质资源对七叶皂苷钠系列药品的生产企业从源头保证优质中药材的品质尤为重要。近年较多的学者基于简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR）分子标记，开展药用植物的遗传多样性及遗传结构分析、物种鉴别、遗传连锁图谱等研究,其是基于串联重复序列两侧的保守序列设计引物进行PCR 扩增，通过凝胶电泳分析扩增产物多态性的技术，其具有结果稳定，重复性好，多态性丰富等特点[22]，可为药用植物育种和种质资源保护等提供基因资源和材料选择[23-28]。本研究收集了湖北十堰娑罗子产区的114 份天师栗种质，根据天师栗近缘物种七叶树基因组开发高多态性SSR 分子标记，结合遗传多样性数据和有效成分七叶皂苷A 和七叶皂苷B 的含量，构建十堰地区天师栗的核心种质库。

1 材料与方法

1.1 材料

选择湖北十堰地区三个居群共114 份生长良好且已挂果的天师栗为研究对象，详细记录地理位置，于展叶期采集其幼叶，用硅胶干燥保存后用于总DNA提取。于白露采集果实，用于成分含量检测。所有样本经湖北中医药大学胡志刚教授鉴定为天师栗（A.chinensisvar.wilsonii）。

1.2 基因组DNA提取

取约30 mg 天师栗叶片，按改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Cetyltrimethylammonium Bromide，）法提取DNA，利用NanoDrop 超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估基因组DNA的总量和质量，合格后调整每份样品DNA 浓度至50 ng·μL-1，并保存至-20℃冰箱中备用。

1.3 SSR引物的筛选和PCR扩增

利用MISA（微卫星识别工具，MIcro SAtellite identification tool）软件，以天师栗近缘种七叶树基因组DNA 为参考进行SSR 位点筛选，在Primer3.0 软件中进行SSR 引物设计，引物设计完成后合成荧光引物。PCR 反应体系总体积为 10 μL，含 DNA 模板 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 5μL、正向引物 0.04 μL、反向引物 0.25 μL、M13 通用引物 0.15 μL、DDH2O 2.6 μL。PCR 反应程序为：预变性（95℃，5 min），变性（95℃，30 s），退火（50-55℃，30 s），延伸（72℃，30 s），共35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.4 核心种质库构建

采用最小距离逐步取样策略（the least distance stepwise sampling strategy，LDSS），结合遗传多样性数据和有效成分含量数据进行取样，连续去除遗传相似性大且有效成分含量相对较低的种质，多次聚类直至获得占总种质资源50%的第一个核心种质，再按照相同方法依次获得分别占总种质资源40%、30%、20%、10%的4 个核心种质。对上述初步得到的5 个比例的核心种质库进行遗传多样性评价，结合遗传多样性与七叶皂苷含量确定最终核心种质，并利用SPSS软件对原始种质与核心种质、原始种质与保留种质进行T检验，以验证最终核心种质是否具有显著性差异。

1.5 数据统计分析

利用Popgen1.32软件对以下遗传多样性参数进行评估，包括：等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon’s 信息指数（I）、近交系数（Fis）、遗传分化系数（Fst）、基因流（Nm）、Nei’s 基因多样性指数（H）；利用PIC_CALC 软件计算多态性信息含量（PIC）；使用NTsys1.2 软件基于UPGMA 进行聚类分析；采用GenALEx 6.5软件进行PCoA 和 AMOVA 分析；采用 Structure3.0 软件进行遗传结构分析。

2 结果与分析

2.1 基于SSR标记分析天师栗的遗传多样性

2.1.1 SSR分子标记开发

采用天师栗的近缘种七叶树的全基因组序列，共发掘出57,349 个SSR 位点，以复合形式存在的SSR 有7,246 个。从基因组染色体序列总共获得PCR 扩增效果好、多态性高的SSR引物13对（表1）。

表1 13对SSR引物信息

2.1.2 SSR位点的多态性水平检测

13 对SSR 位点在114 份天师栗种质中共扩增出94 个等位基因（表2），等位基因（Na）数量从2（SQ7 和SQ8）到 15（SQ18）不等，平均扩增出7.2308 个等位基因；有效等位基因（Ne）的范围从 1.4824（SQ6）至9.9624（SQ18），平均值为3.3712；观测杂合度（Ho）和预期杂合度（He）的范围分别是0.2368（SQ6）-0.7105（SQ22）和0.3268（SQ6）-0.9036（SQ18），平均值分别为0.5067 和0.6059；13 个位点的多态性信息含量指数（PIC）范围在0.3134（SQ6）-0.8911（SQ18）之间，平均值为0.5593，表明所选SSR 位点具有较高的多态性。Shannon’s 信息指数（I）的变化范围是0.6270（SQ8）-2.4446（SQ18），平均值为1.2679。Nei’s基因多样性指数（H）平均为0.6032。基因流（Nm）水平为2.2634（SQ30）-15.1299（SQ53）。遗传分化系数（Fst）和近交系数（Fis）分别为0.0406 和0.1374。以上结果表明，天师栗的遗传分化水平较小，存在着较大的基因流。其中，SQ6 和SQ18 具有较高的识别效率及鉴定效率，将在未来娑罗子DNA 指纹数据库构建和品种鉴定中发挥关键作用。

表2 筛选出的13对SSR引物的多态性水平

2.1.3 天师栗居群遗传多样性分析

在3 个居群中，周家坝居群扩增出最多的等位基因（6.6154）和有效等位基因（3.3270），且Shannon’s 信息指数（1.2460）最高，表明在3 个采样点中，周家坝居群拥有较丰富的遗传变异。普龄的遗传多样性最低（表3）。AMOVA 分析结果显示，遗传变异主要发生在居群内部（95%），只有5%的变异发生在居群间（表4）。3 个居群间遗传分化较小（0.024-0.105），表明存在着较大的基因流。其中，周家坝和辽叶居群间具有较近的遗传亲缘关系（表5）。

表3 天师栗3个居群的遗传统计情况

表4 天师栗3个居群的分子方差分析（AMOVA）分析

表5 3个天师栗居群间的成对遗传分化系数矩阵

2.1.4 天师栗居群遗传结构分析

通过对基因分型得到的SSR 等位基因数据进行主坐标分析和UPGMA聚类分析，发现114份天师栗样本未明显的划为不同的亚群（图1-图2）。

图1 天师栗主坐标分析图

图2 114份天师栗样本UPGMA构建聚类树

2.2 不同种质的娑罗子七叶皂苷的含量测定

2.2.1 方法学考察

用甲醇制备七叶皂苷钠对照品储备液，浓度为4.30 mg·mL-1，并逐级稀释成每 1 mL 含七叶皂苷 A 1.44 mg、0.72 mg、0.36 mg、0.18 mg、0.09 mg，含七叶皂苷 B 1.35 mg、0.675 mg、0.3375 mg、0.1688 mg、0.0844 mg，参照2020 版《中华人民共和国药典》娑罗子中含量测定项下[5]，记录色谱峰面积。七叶皂苷A 的回归方程为：y=7,279,566x+136,717（R2=0.9997）；七叶皂苷B 的 回 归 方 程 为 ：y= 6,176,833x + 125,733（R2=0.9997），表明七叶皂苷A 和七叶皂苷B 线性良好；制备供试品溶液连续重复进样6 次，七叶皂苷A 和七叶皂苷B 的峰面积RSD 值分别为0.52%、0.43%，结果表明仪器精密度良好；将供试品溶液分别放置0、4、8、12、24、36 h 后开展稳定性考察，得到七叶皂苷 A 和七叶皂苷B 峰面积的RSD 值分别为0.62%和0.58%，表明在36 h 内供试品溶液稳定性良好；平行制备6 份供试品溶液，七叶皂苷A 和七叶皂苷B 的峰面积的RSD值分别为1.27%、1.22%，结果表明该测定方法重复性良好。制备9份供试品溶液，分三组，每组分别加入相当于含七叶皂苷浓度50%、100%、150%的对照品溶液，七叶皂苷A、七叶皂苷B 平均回收率分别为99.87%，100.31%，RSD 分别为1.28%，1.04%，表明该方法的准确性良好。

2.2.2 不同种质娑罗子有效成分含量测定

114 份娑罗子样品按上述方法制备娑罗子样品供试品溶液，计算每份娑罗子药材中七叶皂苷A 和七叶皂苷B的含量（%），3个居群的两种七叶皂苷化合物含量测定结果见表6。3 个居群的娑罗子药材均达到了2020 版《中华人民共和国药典》中规定的含量要求，即七叶皂苷A 含量不低于0.7%。其中周家坝居群中娑罗子的七叶皂苷A 和七叶皂苷B 含量均最高，而在辽叶居群中含量均最低。

表6 3个居群的七叶皂苷A及七叶皂苷B含量测定结果

2.3 天师栗核心种质库构建

2.3.1 核心种质库的初步构建及评价

采用LDSS 取样策略基于遗传距离进行逐步聚类，在全部样本中不断删除遗传相似性大且有效成分较低的样本，多次聚类后分别得到57 份、46 份、34 份、23 份、5 份，分别占原始种质的50%、40%、30%、20%、10%（表7）。随着取样比例的减小，等位基因数量（Na）逐渐降低，观察杂合度（Ho）、预期杂合度（He）、香农信息指数（I）和Nei’s 基因多样性指数（H）分别在0.5734-0.5067、 0.6593-0.6059、 1.3170-1.2594 和0.6400-0.6032 范围内变化。遗传参数值除等位基因数量（Na）和有效等位基因数量（Ne）外，其余均在抽样4 中达到最大值，表明取样比例为20%时更丰富的遗传多样性被保留，最终确定20%抽样比例下的23份种质作为核心种质。

表7 不同取样比例下原始种质和五个初步核心种质的遗传多样性特征

2.3.2 核心种质的检验及评价

T检验结果表明20%抽样比例下的核心种质在遗传上与原始种质间无显著性差异（α=0.05），且遗传多样性参数值均高于原始种质，表明20%抽样比例下构建的核心种质可以充分代表原始种质的遗传变异，且相对于原始种质来说具有更加丰富的遗传多样性。3个居群在该核心种质中均有保留，其中周家坝居群保留种质最多，有12 份，辽叶居群保留6 份、普龄居群保留5份（表8）。

表8 原始种质和核心种质的Ne，I，H的T检验结果

3 讨论

本研究筛选出了13 对高多态性SSR 分子标记用于不同种质资源的天师栗遗传多样性分析，对十堰地区3 个居群114 份天师栗样品进行SSR-PCR 扩增，共扩增得到94个等位基因，平均扩增出6.5个等位基因；物种水平上观测杂合度和期望杂合度分别为0.4233和0.5035；13个SSR位点的F统计量检测显示，天师栗的遗传分化水平很小；各位点的多态性信息含量指数（PIC）平均值为 0.4653，表明 13 个SSR 位点均具备较高的多态性。在3 个居群中，天师栗种质在周家坝居群中具有更丰富的遗传变异，且居群间可能发生较高水平的基因流动，其种子娑罗子作为注射用七叶皂苷钠中药材原料，从遗传角度保持较小差异，固定基原及固定种植基地，有利于从源头控制药材品质。但持续的高水平基因流动会极大地减弱种群间的遗传变异，不利于物种延续，也会引起种质退化，需引进其他区域优质天师栗种群以增加该地区天师栗种群的多样性。

娑罗子含有皂苷类、黄酮类、有机酸类等多种化合物，主要有效药用成分为七叶皂苷类化合物[29-31]。本研究以七叶皂苷A、七叶皂苷B 为评价指标，114 份娑罗子药材中七叶皂苷A 的平均含量（3.99%）远高于药典标准，七叶皂苷B 的平均含量为2.66%；3 个居群中的娑罗子药材的七叶皂苷A 的含量均达到且高于药典标准，其中周家坝居群两种成分的含量最高，而辽叶的最低，表明周家坝的娑罗子药材质量比普龄和辽叶的好，为下一步该地区品种选育提供参考。

核心种质可有效地代表原始种质的特征并保留丰富的遗传多样性[32]。对于中药材而言，在构建核心种质库时，应综合遗传参数和有效成分两个指标。最小距离逐步采样策略（LDSS）方法在很多核心种质库构建中被使用，且具有较好的可行性[33]。LDSS 方法在对遗传相似性较高的材料进行选择时，会优先保留有效化学成分相对丰富的个体，同时保留遗传变异丰富的材料。本研究最终得到34 份核心种质，占原始种质的20%，且3 个居群均有种质保留。本研究将为天师栗的遗传资源保护、新品种选育及种质创新提供科学依据。