样本状态对血浆EB病毒DNA检测结果准确性的影响

王筱雨， 色米热·艾尼瓦尔， 李士军

（1.大连医科大学附属第一医院检验科，辽宁 大连 116011；2.新疆维吾尔自治区莎车县人民医院检验科，新疆 喀什 844700）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属于疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒，有1个双链线性DNA基因组[1]。EBV是一种普遍存在的病毒，主要通过血液和唾液传播，会在宿主体内引发潜伏性感染，还可能引起EBV感染相关疾病，如鼻咽癌、淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、EBV相关的移植后淋巴组织增生性疾病。目前，临床实验室检测EBV的方法主要有EBV特异性抗体检测和EBV DNA定量检测。血清学抗体检测仅可反映病毒感染情况，而实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）可准确反映机体内EBV的复制情况，也是EBV DNA定量检测的标准方法。多种临床样本均可以用于检测EBV DNA载量，如血浆或血清、外周血单个核细胞、全血、鼻咽拭子和组织样本等[2]。血浆EBV DNA水平可用于疾病诊断和感染活动期的评估，也可用于预后和治疗评估，对EBV感染相关疾病的诊断和治疗具有重要意义[3]。血浆EBV DNA检测会受到外来因素或样本本身等因素的影响，干扰是实验室误差的重要来源，直接影响检测结果的准确性。溶血和脂血是最常见的内源性干扰因素，可通过多种机制影响EBV DNA检测结果[4-5]。在大多数情况下，溶血样本是由采血过程不顺、采血后剧烈摇晃、运输过程保存不当、样本转运至实验室后未及时离心等因素导致的。脂血样本最常见的分析前因素是餐后或静脉给药后立即采血、患者的饮食和身体状况，以及一些临床治疗使患者体内存在较多的脂肪乳剂。本研究旨在探讨溶血与脂血是否会对PCR法检测EBV DNA的准确性产生影响，并分析其可能的原因，以规范实验室样本接收和保存规则，指导实验室人员正确处理临床样本，避免分析前因素造成检测结果的不准确。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2020年6月—2021年3月大连医科大学附属第一医院无肉眼可见溶血和脂血的EBV DNA阳性样本40例，随机分为2组，每组20例（覆盖低、中、高水平）。

1.2 方法

（1）模拟溶血样本制备。将EBV DNA阳性样本（20例）与灭菌蒸馏水按照1∶1比例混合作为对照样本。取1例EBV DNA阴性乙二胺四乙酸二钾抗凝全血样本，离心后弃去血浆，用0.9%氯化钠溶液洗涤红细胞数次，然后加入与弃去的血浆等量的灭菌蒸馏水溶解红细胞，使血红蛋白浓度为121.00 g/L；保留一部分原水平血红蛋白溶液，将其与灭菌蒸馏水分别按1∶1和1∶3的比例稀释成另外2个浓度梯度的血红蛋白溶液；将20例EBV DNA阳性样本与血红蛋白溶液进行1∶1混合，制备成EBV DNA含量相同而血红蛋白终浓度分别为60.50、30.25和15.13 g/L的模拟溶血样本。（2）模拟脂血样本制备。将EBV DNA阳性样本（20例）与0.9%氯化钠溶液按照1∶1的比例混合作为对照样本。收集不同患者的浓度为12.72 mmol/L且EBV DNA阴性的三酰甘油混合血浆，保留一部分原水平血浆，将其与0.9%氯化钠溶液分别按2∶1和1∶2的比例稀释成另外2个浓度的三酰甘油混合血浆；将20例EBV DNA阳性样本与三酰甘油混合血浆按照1∶1的比例混合，制备成EBV-DNA含量相同而三酰甘油终浓度分别为6.36、4.24、2.12 mmol/L的模拟脂血样本。采用SLAN-96P实时荧光定量RCR仪（上海宏石医疗科技有限公司）检测EBV DNA含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据采用±s表示，组间比较采用配对样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模拟溶血样本EBV DNA PCR检测结果

血红蛋白浓度为30.25和60.50 g/L时，EBV DNA阳性血浆溶血样本和对照样本的PCR检测结果差异有统计学意义（P<0.05）。血红蛋白浓度为15.13 g/L时，EBV DNA阳性血浆溶血样本和对照样本的PCR检测结果差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 模拟溶血样本EBV DNA PCR检测结果 g/L

2.2 模拟脂血样本EBV DNA PCR检测结果

EBV DNA阳性血浆各浓度脂血样本与对照样本的PCR检测结果差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 模拟脂血样本EBV DNA PCR检测结果 拷贝/mL

3 讨论

PCR技术是一种快速、可靠的检测技术，但由于患者临床样本具有多样性，如溶血、脂血，可能会使PCR检测结果受到影响[6-7]。

本研究结果显示，模拟溶血样本和对照样本在血红蛋白浓度为30.25和60.50 g/L时，EBV DNA PCR检测结果差异有统计学意义（P<0.05），而血红蛋白浓度为15.13 g/L的模拟溶血样本和对照样本PCR检测结果差异无统计学意义（P=0.073），提示溶血对EBV DNA检测结果有影响，但轻微溶血不会影响检测结果。目前，大多商品化PCR检测试剂盒选择扩增的靶序列都是相对稳定的EBV DNA片段，不易受溶血因素的影响，且PCR反应体系也有较大的缓冲作用，所以溶血引起的PCR抑制作用不是很明显。然而，本研究结果显示，当临床样本溶血程度较严重（血红蛋白≥30.25 g/L）时，会影响EBV DNA的检测结果。原因可能是溶血可导致血红素及其他代谢产物的残留，血红素通过卟啉环与Taq酶不可逆结合，抑制了DNA聚合酶，从而降低了PCR扩增效率，导致产生假阴性结果[8]。

乳糜微粒增多可引起脂血样本浑浊，三酰甘油和胆固醇水平可以客观反映脂血的严重程度。脂血样本中的混浊和脂蛋白颗粒会干扰检测结果，其原因是血脂会降低光的透射率，进而影响分光光度分析结果。本研究结果显示，三酰甘油浓度为6.36、4.24 和2.12 mmol/L的模拟脂血样本和对照样本的EBV DNA PCR检测结果差异均无统计学意义（P>0.05）。提示样本中三酰甘油≤6.36 mmol/L时，不会明显抑制PCR反应体系中Tap酶的活性和核酸的扩增。原因可能是血液中三酰甘油的密度较低，经高速离心机离心后会漂浮在上层，弃去上清步骤时可以去除大部分，又经过多次稀释，其干扰作用几乎不存在，但三酰甘油在更高浓度时是否会对EBV DNA定量检测的结果产生影响仍需进一步验证。因此，对于肥胖、高血脂患者的血液样本，在乳糜不严重的情况下也能得到相对准确的EBV DNA检测结果。对于较为严重的乳糜样本，可以采取高速离心、0.9%氯化钠溶液或血清稀释、使用脂质清除剂等方法降低乳糜程度[9]。若仍未改善，应重新采血。

综上所述，在进行EBV DNA定量检测时，应尽量保证采血过程的顺利，避免餐后或静脉给药后立即采血，保证血液样本运输条件，血液样本运输至实验室后应尽快检测，避免放置时间过长导致溶血；若不能立刻检测，应于4℃冰箱冷藏保存样本。如果样本出现溶血、严重脂血等现象，实验室工作人员应按不合格样本处理，通知临床重新采血，以保证检测结果的准确性。