强蠕通便方对慢传输型便秘大鼠的治疗作用及机制研究

王 松，张兆鹏，谢璐璐，连春雨，肖钰雪，史晓梅，王鑫赫，刘玉彤，张海鹏，刘宏岩

（长春中医药大学，长春 130117）

慢传输型便秘（STC）是结肠动力减弱、传输功能减慢、肠内容物停留时间延长、水分过度吸收而出现的便秘[1]。STC 是功能性便秘（FC）的一种，其发病率约占FC的45.5%[2]，其患病率随生活压力的增加、饮食结构与生活方式的改变、人口老龄化的加剧而逐年递增。STC 发病机制较为复杂，目前研究涉及了肠神经系统、肠道平滑肌、Cajal 间质细胞、水通道蛋白、肠道菌群等多个方面[3-6]。

刘宏岩教授对于STC的治疗有着丰富的临床经验，认为“阳虚湿盛，气机升降失调”为STC 的根本病机。基于此，提出了益气温里行气化湿通便法并拟强蠕通便方治疗STC。本实验旨在探究强蠕通便方对STC 模型大鼠的通便效果及作用机制。

1 材料

1.1 动物40只SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。

1.2 药物 强蠕通便方（炙黄芪、人参、茯苓、炒白术、姜厚朴、炒枳实、豆蔻、干姜、酒肉苁蓉、锁阳、炮附子、炙甘草）及生大黄均购于长春中医药大学附属第三临床医院。枸橼酸莫沙必利片（福建海西新药创制有限公司生产，规格：每片5 mg）。生大黄粉悬浊液制备：将生大黄粉碎，后过100 目筛，纯净水混合均匀。强蠕通便方药液制备：将炮附子先煎煮1 h，与此同时浸泡余药，混合所有药液武火煮沸后文火煎煮40 min，将药液滤出，再加水煎煮40 min，将两次滤液混匀，浓缩成2.67 g/mL 的药液，晾至室温，密封后4 ℃保存。莫沙必利药液制备：将莫沙必利粉碎，纯净水混合均匀，制备成1.65 mg/mL 的药液，密封，4 ℃保存。

1.3 试剂 阿拉伯树胶粉（天津市大茂化学试剂厂）；活性炭（粉）（天津市光复科技发展有限公司）；自噬效应蛋白（Beclin-1）、微管相关蛋白轻链3（LC3）蛋白抗体（Proteintech 公司）。

1.4 仪器 电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-7C）；智能荧光化学发光成像系统（广州光仪生物科技有限公司，型号：JY-MINI610）。

2 方法

2.1 造模与分组 将40 只SD 雄性大鼠适应性饲养7 d，随机分为正常组、模型组、强蠕通便方组、莫沙必利组。除正常组外，其余各组均采用生大黄细粉悬浊液灌胃每日1 次，首日剂量为200 mg/（kg·d），后每日剂量按首日量递增，半数大鼠稀便时维持此剂量灌胃，至80%大鼠无稀便。按此法循环3 次，待第3 次结束时，继续灌胃1周。正常组同时灌服等量生理盐水。

2.2 治疗 造模成功后，强蠕通便方组给予26.25 g/（kg·d）的强蠕通便方药液，莫沙必利组给予1.65 mg/（kg·d）的莫沙必利药液，正常组与模型组分别给予相应体积的生理盐水，连续给药28 d。

2.3 观察大鼠一般状态 观察大鼠的一般状态，包括粪便性状、活动度、精神状态和皮毛情况等。

2.4 粪便检测 制备5%碳末悬浊液：称取10 g 阿拉伯树胶粉倒入装有80 mL 蒸馏水的器皿中搅匀，煮沸至透明，加入5 g 活性炭粉，煮沸3次后，晾至室温，定容至100 mL 即为5%碳末悬浊液，4℃保存。首粒黑便排出时间：所有大鼠于检测前禁食不禁水12 h，经口灌入5%碳末悬浊液2 mL，正常饮食饮水，灌胃结束开始计时，排出首粒黑便计时结束，该过程所需时间为大鼠排出首粒黑便的时间。

2.5 血清检测 10%水合氯醛腹腔注射以麻醉大鼠，将腹主动脉完全暴露，取血、离心，取上清液按照ELISA 相对应试剂盒的说明书进行操作，测得大鼠血清TNF-α、IL-6 的含量。

2.6 病理形态学检测 结肠组织固定于4%的多聚甲醛，石蜡包埋，切片HE 染色，光镜下观察。

2.7 Western 印记检测 称取50 mg 冻存结肠组织，超生低温粉碎研磨，加入RIPA 裂解，在冰上充分裂解30 min，4 ℃、15 000 r/min 低温高速离心15 min，后提取其上清液，通过BCA 试剂盒进行蛋白定量，高温煮沸以使蛋白变性。采用SDS-PAGE 法凝胶电泳，转蛋白至PVDF 膜，使用脱脂奶粉封闭，加入目的蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。加入相应二抗室温孵育1 h，TBST 清洗，ECL 化学发光显影，拍照。ImagJ 软件计算蛋白表达量。

2.8 统计学分析 采用SPSS 26.0 进行数据分析，使用Graphpad Prism 构建图形，计量资料以均数±标准差（）表示。以单因素方差分析来比较多组间的差异。

3 结果

3.1 大鼠一般状态变化情况 造模期间，各组大鼠粪便先变稀，后转为干硬，喜抱团，毛发无光泽，肌肉松弛，甚至出现脱肛现象。强蠕通便方与莫沙必利治疗后大鼠粪便由干硬变软，不抱团，毛发有光泽，肌肉松弛有度，脱肛现象消失。

3.2 各组大鼠首粒黑便排出时间 与正常组相比，模型组大鼠排出首粒黑便的时间明显较长（P＜0.01）。与模型组相比，强蠕通便方组大鼠排出首粒黑便的时间在第1 周较短；第2 周进一步较短（P＜0.05）；第3 周、第4 周强蠕通便方组大鼠排出首粒黑便的时间均明显较短（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠首粒黑便排出时间（，n =10） min

表1 各组大鼠首粒黑便排出时间（，n =10） min

注：与正常组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3 各组大鼠血清炎症因子含量 与正常组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，强蠕通便方组血清中TNF-α、IL-6 含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠血清炎症因子含量

3.4 各组大鼠结肠组织病理形态学变化 正常组大鼠结肠黏膜结构完整，杯状细胞丰富、排列整齐，细胞间无水肿；模型组大鼠结肠黏膜层变薄，杯状细胞断裂、数量减少、排列不规整，细胞间水肿；强蠕通便方组结肠黏膜结构完整，杯状细胞无断裂、数量较丰富、排列较规整，细胞间无水肿。见图2。

图2 各组大鼠结肠组织病理形态学变化（HE，×400）

3.5 各组大鼠结肠组织自噬相关蛋白含量 与正常组相比，模型组Beclin-1、LC3-II/LC3-I、P62 表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。与模型组相比，强蠕通便方组Beclin-1、LC3-II/LC3-I、P62 表达均明显升高（P＜0.01）。见图3。

图3 各组大鼠结肠组织自噬相关蛋白含量

4 讨论

本研究通过灌服生大黄粉悬浊液成功制备了STC大鼠模型。模型制备过程中大鼠先出现了腹泻。蒽醌类衍生物作为大黄的有效成分能够使平滑肌M 受体兴奋而加速肠蠕动，亦可抑制肠黏膜的钠泵酶活性，通过阻碍Na+主动转运，抑制水分吸收，以达致泻作用。随着灌胃时间延长，大便由稀变干，排便时间延长。长期服用大黄可损伤肠神经系统，降低结肠传输功能，而致便秘[7]。造模过程由于不断泄泻而耗伤阳气和津液，但以耗伤阳气为主。脾阳受伤，运化失司，水液、水谷运行障碍，湿阻气滞，大便排泄不畅，而见大便粘滞不爽，次数减少，即形成便秘。临床中发现许多便秘患者都可见大便粘滞不爽、排便次数减少，伴疲乏无力，畏寒肢冷，腹胀满，舌淡、体胖大、有齿痕、苔白厚腻或滑，脉沉缓或沉濡等症状。其中，很大一部分是从服泻药开始逐渐形成便秘的，与此模型同理。张仲景亦在《金匮要略·腹满寒疝宿食脉证治》中提到阳虚便秘即“趺阳脉微弦，法当腹满，不满者必便难……此虚寒从下上，当以温药服之”。基于此，提出益气温里行气化湿通便法，并据法拟强蠕通便方用以治疗STC，临证疗效显著。方中黄芪、党参、茯苓、白术四药合用可益气、补虚，具有增强胃肠蠕动的作用[8]；方用干姜、附子共奏温里之功，具有增强胃肠蠕动、增强机体代谢的作用[9-10]；方配伍枳实、厚朴、白豆蔻以化湿行气，具有增强胃肠蠕动的作用[11-12]；肉苁蓉、锁阳可补肾阳、通便，实验研究发现肉苁蓉、锁阳可增加便秘小鼠小肠推进度，增强胃肠蠕动[13-14]；炙甘草调和诸药。全方合用共奏益气温里行气化湿通便之功，增强了胃肠蠕动功能，从根本上治疗STC。

有研究表明，便秘患者的血清炎症因子有较为显著的增加[15]。炎症因子TNF-α、IL-6 的持续产生可导致结肠黏膜发生炎症反应而损伤肠黏膜屏障，降低肠道运动功能[16]。本次研究结果中STC 大鼠血清的TNF-α、IL-6 含量有明显的升高。研究显示黄芪主要活性成分黄芪甲苷具有抗炎作用[17]，厚朴的主要活性成分厚朴酚有明显的抗炎活性[18]。翟勇聪发现附子-干姜药对可降低炎症因子表达，抑制炎症反应[19]。由此看出补气、温里、行气化湿类中药可起到抗炎作用。本方应具有抗炎作用。研究结果显示该方降低了STC大鼠血清中TNF-α、IL-6含量，莫沙必利则无显著影响。故在抑制炎症反应发生，修复结肠损伤而改善肠道运动方面，强蠕通便方优于莫沙必利。

杯状细胞为结肠黏膜的黏液分泌细胞。研究显示，便秘大鼠结肠黏膜杯状细胞数量减少，黏液分泌减少[20]。本研究HE 结果显示STC 大鼠结肠黏膜层变薄，杯状细胞断裂、数量少，提示STC 大鼠结肠黏膜受损、粘液分泌受限。强蠕通便方能够修复结肠黏膜损伤，作用效果优于莫沙必利。

自噬是细胞内的一种降解方式[21]。在基础水平上，细胞自噬可以维持能量代谢和物质再利用，故细胞自噬水平在一定程度上可反应细胞代谢水平。近年来，有研究表明肠道黏膜屏障的损伤与结肠组织自噬水平降低有关[22]。自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II/I、P62的表达量可反应自噬水平[23]。本研究发现，STC 大鼠结肠组织Beclin-1、LC3-II/I、P62 表达显著降低，强蠕通便方可明显增加Beclin-1、LC3-II/I、P62 表达，调节结肠组织细胞自噬，增强细胞代谢，改善便秘。莫沙必利可增加LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62 表达，但对Beclin-1 无显著影响，故在调节细胞自噬方面，强蠕通便方优于莫沙必利。

综上，强蠕通便方通过降低血清炎性因子TNF-α、IL-6 含量，调节自噬和凋亡信号通路有效改善STC 模型大鼠排便功能。