循经通络推拿结合药物对乳腺增生大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的影响

纪 宁，李 丽，阮 迪，李丹丹

（新疆维吾尔自治区中医医院推拿科，乌鲁木齐 830099）

乳腺增生症（mammary gland hyperplasia，MGH）是中青年女性最为常见的一种乳腺疾病，主要以乳房非炎性肿块及周期性胀痛为临床特征[1]，中医有“乳癖”之称。乳腺增生症的发病机制目前已公认与内分泌激素失调所致的雌激素分泌绝对升高，孕激素分泌绝对或相对不足相关，下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴是调控乳腺生理和病理变化的关键途径，其功能的紊乱与乳腺增生症发生发展关系密切[2]。推拿治疗具有无不良反应、远期疗效好、患者易于接受的优势，在大量临床研究中已验证其作用于乳腺增生症的有效性。本实验采用孕雌激素联合造模法复制乳腺增生症大鼠模型，观察循经通络推拿手法及抗雌激素药物三苯氧胺单纯或联合应用对乳腺增生症大鼠的治疗作用，并探讨其通过调控下丘脑-垂体-卵巢轴治疗乳腺增生症的相关机制。

1 实验材料

SD 雌性大鼠50 只，SPF 级，体质量（180±220）g，由新疆医科大学动物实验中心提供，于温度（23±3）℃、相对湿度 40%～70% 的环境下适应性饲养1 周。苯甲酸雌二醇注射液、黄体酮注射液（北京索莱宝有限责任公司），三苯氧胺（上海华联制药有限公司），苏木素染液（福州迈新生物技术开发有限公司），伊红染液（北京中杉金桥生物技术有限公司），大鼠卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒均（武汉华美生物工程有限公司），促性腺激素释放激素（GnRH）、垂体促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）一抗（北京博奥森生物技术有限公司），Real-time PCR 试剂盒（TaKaRa 公司）。高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司），酶标仪、电转仪（美国Bio-Rad 公司），电泳仪（北京六一生物技术有限公司），光学倒置显微镜（日本尼康），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），RT-RCR 仪（美国 ABI 公司）。

2 实验方法

2.1 造模方法 大鼠按体质量随机分为5 组（对照组、模型组、手法组、药物组、药物加手法组），每组10只。除对照组外，其余各组均采用肌肉注射雌二醇和黄体酮法制备乳腺增生症模型[3]：肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mL/kg），每日1 次，持续25 d，继而改用黄体酮注射液（5 mg/kg）肌肉注射，每日1 次，持续5 d。造模结束后，观察各组大鼠乳头外观形态，测量乳头直径与高度，并取第2对乳房组织作标本切片，行苏木素-伊红（HE）染色观察病理形态改变。以大鼠乳头红肿竖起高于皮肤表面，乳头直径、高度增加，HE染色见乳腺小叶增多、导管及腺泡腔扩张等为造模成功。

2.2 治疗方法 手法组于造模同时给予循经通络推拿手法：1）指腹直推大鼠前肢内侧至腋窝处（手三阴经），并延乳房外围向乳头方向指揉乳络；2）指腹直推大鼠后肢内侧根部至后掌足跖（足三阴经）；3）指腹直推大鼠颈部至耻骨（任脉）、颈部至尾根部（督脉）；4）指揉大鼠乳房部；直推、按揉力度、速度适中、顺逆经交替，每次治疗10 min，至局部皮肤发红。药物组给予三苯氧胺（0.5 mg/kg）灌胃，药物加手法组同时给予三苯氧胺（0.5 mg/kg）及循经通络推拿手法治疗，每日 1 次，连续30 d。对照组与模型组不予干预。

3 检测指标

3.1 大鼠乳头直径与高度测量 治疗结束后，各组大鼠第2 对左右乳头用精密游标卡尺测量直径与高度，比较模型组与对照组，治疗组与模型组以及各治疗组之间的差异。

3.2 HE 染色观察乳腺组织病理形态变化 大鼠腹主动脉取血后处死，解剖后取第2 对右侧乳房，取部分乳腺组织于4 %多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片机作 5 μm 切片后行苏木素-伊红（HE）染色，中性树胶封片，光学显微镜于不同倍数下观察乳腺组织形态学改变并拍照。

3.3 ELISA 实验检测血清FSH、LH 含量变化 大鼠麻醉后腹主动脉取血，3 000 r/min 离心10 min 取血清，按ELISA 试剂盒说明书要求操作：样品孔加入样品稀释剂40 μL、检测抗体100 μL 及血清样品10 μL，置于37 ℃恒温箱重孵育1 h，洗涤剂洗板5 次，加入显色液A、B 各50 μL，于37 ℃恒温箱中避光孵育15 min，随后加入终止液50 μL，于酶标仪450 nm 下检测各反应孔OD 值，建立标准曲线，代入各样本OD 值计算FSH、LH 的含量。

3.4 Western-blot 检测下丘脑GnRH 与垂体GnRH-R 蛋白表达 取各组大鼠下丘脑和垂体组织，剪碎后置于裂解液中，匀浆器于冰上匀浆，12 000 r/min 离心 20 min提取总蛋白，BCA 法检测组织蛋白浓度。经制胶、上样、电泳、转膜及封闭后，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃下孵育2 h，ECL 发光液孵育，凝胶成像系统曝光，以β-actin 为内参测定各组灰度值，分析相对蛋白含量。

3.5 RT-PCR 检测下丘脑GnRH与垂体GnRH-R mRNA 表达 取大鼠部分下丘脑及脑垂体组织，Trizol法提取组织总RNA，测定总RNA 浓度，分别进行逆转录、cDNA 扩增，引物序列为：GnRH 上游引物5’-CCGCTGTTGTTCTGTTGACT-3’，下游引物5’-GCAGATCCCT AAGAGGTGAA-3’；GnRH-R上游引物 5’-TCACTCAGCCCTTAGCTGTCC-3’，下游引物 5’-GAAGGCTTCATGCCACCATTG-3’。反应条件为：95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行 40个循环。以2-△△Ct法分析mRNA相对表达量。

3.6 统计学处理 采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，数据均以均值±标准差（）表示，两组以上数据采用单因素方差分析比较。

4 结果

4.1 大鼠乳头直径与高度比较 与对照组比较，模型组两侧乳头高度、直径增大明显（P＜0.05）；各治疗组乳头高度和直径较模型组显著减小（P＜0.05）；其中药物组乳头直径、药物加手法组乳头高度和直径较手法组减小更为明显（P＜0.05）；药物加手法组大鼠左侧乳头直径较药物组减小更为明显（P＜0.05），见表 1。

表1 各组大鼠乳头直径及高度比较（，n =10） mm

表1 各组大鼠乳头直径及高度比较（，n =10） mm

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05；与药物组比较，□P ＜0.05

4.2 大鼠乳腺组织病理形态学观察 对照组乳腺小叶形态规则，未见明显增生，腺泡较少，腺泡腔及导管管腔未见扩张，个别导管内可见少量分泌物；模型组可见乳腺小叶增生，腺泡增大，导管管腔扩张，导管上皮细胞增生，导管内含较多分泌物；与模型组相比，手法组和药物组大鼠乳腺组织病变改善不明显，药物加手法组乳腺小叶增生减少，乳腺导管扩张减轻，导管内分泌物减少，见图 1。

图1 各组大鼠乳腺组织病理学变化（HE 染色）

4.3 大鼠血清FSH、LH 水平比较 药物组和药物加手法组FSH 水平较模型组明显降低，LH 水平明显升高（P＜0.05），其中药物加手法组与手法组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表2 各组大鼠血清FSH、LH 水平（，n =10）

表2 各组大鼠血清FSH、LH 水平（，n =10）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05

4.4 大鼠下丘脑GnRH 与垂体GnRH-R 的蛋白表达 药物加手法组GnRH、GnRH-R 的表达较模型组均明显减少（P＜0.05），其中药物加手法组与手法组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠下丘脑GnRH 与垂体组织GnRH-R 的蛋白表达（，n =6）

表3 各组大鼠下丘脑GnRH 与垂体组织GnRH-R 的蛋白表达（，n =6）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05

4.5 大鼠下丘脑GnRH 与垂体GnRH-R 的mRNA表达 药物组、药物加手法组较模型组明显减少了GnRH、GnRH-R 的mRNA 表 达（P＜0.05），其 中药物加手法组与手法组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 4。

表4 各组大鼠下丘脑GnRH 与垂体组织GnRH-R 的mRNA 表达（，n =6）

表4 各组大鼠下丘脑GnRH 与垂体组织GnRH-R 的mRNA 表达（，n =6）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05

5 讨论

近年来，乳腺增生症发病率逐年上升，发病趋势呈现低龄化，且伴有一定的癌变风险，受到中青年女性的极大关注[4]。西医针对此病常采用抗雌激素类药物治疗，但存在副作用多、不适合长期应用、停药后易复发等缺点[5]。推拿作为中医特色疗法，通过推揉按摩经穴而激发经络气机，达到疏通经络，行气运血的作用，以其远期疗效好、无不良反应等优势得到了患者的广泛认可[6]。

乳腺增生症属于中医学“乳癖”范畴，病属本虚标实，以肾气不足，冲任失调为本，肝脾郁结，气滞、痰凝、血瘀凝滞为标，故治疗当以调节冲任，疏肝健脾为主，配以化痰散结，畅通经络之法[7-9]。乳房为“宗经之所”，多条经脉在此汇聚[10]，足厥阴肝经布于两胁，环绕乳头而行；足太阴脾经络胃，上膈，散布胸胁，行至乳头之外；足少阴肾经贯肝膈，其支脉入胸中，故循经推拿以足三阴经为主。冲任二脉同起于胞中，冲脉与足少阴经并行向上而布于胸中，任脉行于两乳之间，乳房的生理病理状态直接受此二脉经气盈亏的调节[11]；督脉行于背脊正中，为“阳脉之海”，任脉为“阴脉之海”，二脉通调则百脉皆通[12]。此外，手三阴经分布于上肢及腋窝，过胸部乳头外侧，肝有邪常客于两腋，手法作用于此三脉亦可达到疏肝散结之效。

本研究采用循经通络推拿手法作用于大鼠足三阴、手三阴经、任脉、督脉和乳房部，在此基础上结合西药三苯氧胺，观察西药和手法单独或联合应用对乳腺增生大鼠的治疗效果。

结果显示，与模型组比较，各治疗组大鼠第2 对乳头直径与高度均显著减小，其中手法加药物组效果最明显。HE 染色可见，模型组乳腺组织增生病变明显，提示造模成功，药物加手法组明显减轻了乳腺组织的病变程度，而药物组和手法组对病变改善均不明显，提示推拿联合药物的治疗效果优于单纯应用手法和药物。

乳腺增生症的发生与下丘脑-垂体-卵巢轴的功能紊乱密切相关[13]。下丘脑所分泌的 GnRH 是下丘脑-垂体-卵巢轴中最为关键的神经介质，其与垂体促性腺细胞上具有高亲和力的受体GnRH-R 结合后，能够刺激垂体合成和释放FSH 和LH，二者的分泌进一步作用于卵巢，刺激卵巢分泌雌激素与孕激素，从而调节乳腺组织的生理和病理改变[14]。过量分泌的FSH 可激活卵巢颗粒细胞合成和释放雌二醇（E2），导致乳腺增生症[15]。而LH 含量的降低可造成 P 的生成不足，E2和P 之间平衡被打破，使E2生成过多，使乳腺增生症间接加重[16]。本实验结果提示推拿手法联合药物可能通过干预下丘脑-垂体-卵巢轴的内分泌功能，使GnRH 及其受体的生成减少，从而调节FSH 和LH 的分泌水平，拮抗激素紊乱引起的乳腺增生症。

前期研究发现，循经通络推拿疗法用于乳腺增生症患者临床总有效率可达100%[17]。本实验中单纯应用推拿手法显著减轻了乳腺增生症大鼠乳头高度和直径的增大，提示其对外源性雌激素所致乳腺增生症具有明显疗效。病理学和分子检测中虽未见明显改善，但联合药物治疗时却发挥了协同作用。推拿等保守疗法疗程长，对症状的改善见效较慢；三苯氧胺等抗雌激素药物疗效明显，但停药后易复发。本实验显示循经推拿手法联合三苯氧胺具有一定的协同增效作用，提示内服与外治并重对下丘脑-垂体-卵巢轴功能和激素水平能够起到更好的调节作用。