利用洛南废次烟叶提取茄尼醇的工艺研究

孙 楠，任有良，孙强强，王毅梦

(商洛学院 化学工程与现代材料学院/陕西省尾矿资源综合利用重点实验室，陕西 商洛 726000)

陕西省商洛市洛南县是国家确定的首批整县推进的现代烟草农业示范县，年平均种植烤烟0.67万hm2，“十三五”期间，洛南县烤烟面积要稳定在0.67万hm2。由于烟叶生产标准提高，产生了大量的残次烟叶以及烟，焚烧产生大量的烟尘雾霾，破坏大气环境，还污染土壤，对烤烟生产持续发展产生不利影响，因此，利用废次烟叶生产茄尼醇、烟碱、活性炭及有机肥[1～4]，有利于保护环境、烤烟生产可持续发展，增加烟农收入，精准扶贫。目前，茄尼醇主要应用于合成维生素K2和辅酶Q10，其中辅酶Q10的合成最具有应用和商业价值[5～8]。辅酶Q10具有改善心肌代谢障碍的作用，是细胞内产生能量所必不可少的辅酶助因子，作为人体细胞呼吸和代谢的激活剂以及机体的免疫增强剂，用于治疗急慢性肝炎、亚急性肝坏死、心脑血管等疾病[8～10]。虽现有不少企业在生产茄尼醇，但因生产技术落后，工艺陈旧，产品质量不稳定，生产成本高，经济效益低而无市场竞争力[11～14]。这些低含量的的茄尼醇不能直接作为药用原料，导致我国粗品茄尼醇出口到日美等国家后，被精制加工成含量以上精品茄尼醇万元吨或合成辅酶Q10后再返销国内[15～17]。笔者研究废次烟叶中茄尼醇的提取纯化新工艺，改进传统的提取技术，获取高收率和高质量的茄尼醇产品，使之符合现代医药生产和产品的要求，力求在提高茄尼醇产品质量、降低生产成本、充分利用资源等方面有所改进或突破。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

废次烟叶，2019年3月采摘于陕西省商洛市洛南县；茄尼醇标准品，四川省维克奇生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析纯)，天津市津东天正精细化学试剂厂；石油醚(分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司；羧甲基纤维素钠(分析纯)，天津市河东区红岩试剂厂；薄层层析硅胶G(分析纯)，青岛海洋化工有限公司；冰乙酸(分析纯)，天津市百世化工有限公司。

数显式电热恒温水浴锅(HHS-11-1型)； 旋转蒸发仪(220V 50/60Hz型)； 小型样品粉碎机(SA-10型)。

1.2 实验步骤

1.2.1 烟草原料预处理 将清洗过的烟叶置于烘箱中在60℃下烘3 h，粉碎，置于密封袋中备用。

1.2.2 茄尼醇粗提方法 精确称取预先处理过的样品10g置于250mL平底烧瓶中，以固液比1∶10的比例加入100 mL的石油醚溶剂，将烧瓶置于数显式电热恒温水浴锅发生装置中，在50℃下提取6h后取后进行抽滤。滤液通过旋转蒸发仪浓缩除去有机溶剂后，剩余物即为烟草茄尼醇粗提物。

1.2.3 茄尼醇粗提物的皂化 称取一定量茄尼醇粗提物于250 mL平底烧瓶中，加入50 mL 0.2 mol/L NaOH乙醇溶液，在50℃下皂化反应2 h，停止反应，旋转蒸发除去乙醇得褐色粘稠物，再向烧瓶中加入50 mL蒸馏水，加热搅拌并滴加盐酸调节pH=7，再用石油醚萃取3次(50 mL×3)，合并石油醚层，用蒸馏水反洗一次，旋转蒸发石油醚萃取液得茄尼醇纯品。

1.2.4 茄尼醇定性测定 用薄层色谱法来定性测定废次烟叶皂化后的样品中茄尼醇的存在。用石油醚溶解茄尼醇标准样和测试样，配置成一定浓度的试液，在一块硅胶层析板上同时用毛细管点上标准样和测试样，然后将层析板置于展开溶剂中展开，展开溶剂不要没过硅胶层析板下端10 mm处，待展开溶剂前沿达到五分之四处时取出层析板，待溶剂挥发后用碘蒸气显色。

固定相： 预制硅胶板

流动性(展开剂)： 石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸=4∶1∶0.5

显色剂： 碘蒸气

展开方式： 平行展开

1.2.5 茄尼醇定量测定 称取茄尼醇标准品0.020 g，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容得0.4 g/L茄尼醇标准品溶液。分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的茄尼醇标准品溶液于10 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀，制备成一系列质量浓度的茄尼醇标准品溶液，于210 nm波长下采用紫外-可见分光光度计法测其吸光度。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

茄尼醇薄层色谱结果如图1所示：

Rf=溶质移动的距离/溶液移动的距离

左边是茄尼醇标准品，右边是样品茄尼醇提取液，经计算，茄尼醇标准品Rf=0.68，样品提取液Rf=0.676 0，样品与标准样的Rf值的数据相符，确定提取出的产品为茄尼醇。如图1所示：

图1 薄层色谱

2.2 定量分析

根据茄尼醇定量测定的方法，将吸光度(A)与质量浓度(c)回归得标准品茄尼醇在95%乙醇中的线性方程为:

A=7.164 3c+0.625 8 R2=0.996 4 如图2所示。

在提取的茄尼醇样品中加入95%乙醇定容至50 mL容量瓶中，用紫外分光光度计测定其吸光度，根据茄尼醇标准品的标准曲线回归方程算出茄尼醇粗品的质量，进而得出茄尼醇的提取率。

茄尼醇提取率=茄尼醇质量/烟草原料质量×100%

2.3 提取茄尼醇的影响因素

2.3.1 浸提溶剂对提取率的影响 溶剂筛选试验提取条件为温度50 ℃，时间6 h， 料液比1∶10(g/mL)，筛选溶剂分别为石油醚，丙酮，乙醇，乙酸乙酯，筛选指标为茄尼醇提取率和溶剂价格。

图2 茄尼醇标准品标准曲线

不同溶剂对茄尼醇的提取率如表1所示。

表1 不同溶剂对茄尼醇的提取率

从表1可以看出，石油醚的提取效果最好，乙酸乙酯和无水乙醇的提取效率没有石油醚的好，其原因是因为茄尼醇的极性较小，根据相似相容原理，茄尼醇在低极性的溶剂石油醚中溶解度比在高极性的无水乙醇和乙酸乙酯中溶解度大，因此应选极性小的石油醚作为提取溶剂，从溶剂成本上考虑，石油醚作为提取溶剂更合适。所以最佳浸提溶剂为石油醚。

2.3.2 浸提温度对提取率的影响 实验条件为浸提溶剂石油醚，浸提时间6 h，料液比1∶10，提取温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，浸提温度对提取率的影响如3所示：

图3 浸提温度对提取率的影响

由图3可知，随着温度的升高，茄尼醇的提取率在50℃达到最大。因为在较高的提取温度下有利于植物细胞膜、细胞壁和纤维结构的破坏，且样品的颗粒越小这种破坏程度会增强，所以，提取温度的升高，不仅有助于细胞膜、细胞壁和纤维结构的继续破坏，而且还增大了茄尼醇在石油醚中的溶解度和分子的运动速度，在浓差化学势的作用下使茄尼醇继续释放出来，使得茄尼醇提取率随之相应增加。但当温度高于50℃后，会引起茄尼醇分子的衰变，从而降低茄尼醇的提取率。因此茄尼醇的最佳浸提温度为50℃。

2.3.3 浸提时间对提取率的影响 实验条件为浸提溶剂石油醚，浸提温度50℃，料液比1∶10，筛选浸提时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，如图4所示：

图4可知，提取时间低于6 h 时，提取率的增长很快，因为烟叶的细胞膜、细胞壁和纤维结构的破坏需要适当的温度，还需要时间去降低提取液的扩散阻力，在浓差化学势的作用下，逐渐提取出烟叶细胞壁中的茄尼醇。随着提取时间的增长，细胞膜、细胞壁和纤维结构被大部分破坏，茄尼醇的提取率随着提取液的扩散速度增大也快速增大。当提取时间超过6h后，细胞膜、细胞壁和纤维结构被破坏掉，进到提取液中茄尼醇的量也越来越多，但提取液和烟叶细胞中茄尼醇的浓差化学势作用逐渐减小，茄尼醇提取率增长速度逐渐减小，因而茄尼醇提取率随时间的延长变化缓慢。所以茄尼醇的最佳提取时间是6 h。

图4 浸提时间对提取率的影响

2.3.4 料液比对提取率的影响 实验条件为浸提溶剂石油醚，浸提温度50℃，浸提时间6 h，筛选料液比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，如图5所示：

图5 料液比对提取率的影响

由图5看出，随着料液比的增大，茄尼醇的提取率也增大，在料液比为1∶10时达到最大，之后，随着料液比的增大，虽然提取率在增大，但增长速度很慢。当提取液较少时，随着溶出的茄尼醇，很快在提取液中达到分配平衡，这样烟叶中可提取的茄尼醇不能充分进入到提取液中被提取，从而降低提取率。要溶出更多的茄尼醇才能使茄尼醇在烟叶和提取液间达到分配平衡，这时两相中的渗透压也相应增大，使越来越多的茄尼醇进入到提取液中，则提取率逐渐增大。当料液比达到1∶10时，一方面，烟叶中茄尼醇含量很低，另一方面，提取液含量过大，这时，从烟叶溶出少量的茄尼醇很快达到分配平衡，而提取液中茄尼醇浓度无明显变化，所以提取率几乎没有明显增加。所以提取茄尼醇最佳料液比为1∶10。

3 结论

(1)利用洛南废次烟叶烟杆提取茄尼醇的工艺研究路线：先将废次烟叶洗净、粉碎、烘干，通过加入有机溶剂浸提一定时间，旋转蒸发除去有机溶剂，得到粗提物，进行皂化，旋转蒸发除去皂化液，加蒸馏水，调节pH，萃取，洗涤，再次旋转蒸发，得到皂化物，最后对产品鉴定。

(2)经薄层色谱法测定，测试样的Rf值是0.676，与标准样的Rf值0.68的数据相符，确定提取出的产品为茄尼醇。

(3)通过试验最终得出：采用溶剂法浸提烟叶中茄尼醇的最佳提取工艺条件：浸提液为石油醚，料液比为 1∶10，提取温度为50℃，提取时间为6 h。在此条件下，经过紫外分光光度计法定量测定，烟叶中茄尼醇的提取率为0.10%。