火麻籽粕多酚微波辅助提取工艺及其抗氧化活性

孙晓波，刘卫萍，王小明，张鹏，郭松*

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西 来宾 546199；2.广西科技师范学院壮瑶药品质生物学重点实验室，广西 来宾 546199）

火麻又称工业大麻、汉麻，系桑科大麻属一年生草本植物，在我国主要种植于广西、云南、四川、黑龙江、甘肃等地。火麻应用价值高，火麻茎皮纤维含量丰富常用于造纸。火麻籽作为一种药食同源食材，含有丰富的蛋白质、油脂、碳水化合物、膳食纤维以及矿物质等[1-2]。火麻油是火麻籽经压榨或浸出提取而得，是世界上少数能够溶于水的植物油料，火麻油含有人体必需脂肪酸、多种矿物元素、植物甾醇等，其中不饱和脂肪酸中亚油酸和亚麻酸比例在3.5∶1左右，是一种脂肪酸组成平衡的高品质油脂[3]。近年研究发现，作为“长寿之乡”广西巴马地区主要植物类食用油，火麻油能有效降低人体内脂质过氧化物含量，具有降血脂、预防心脑血管疾病等功效，此外还能促进儿童和青少年大脑发育，是一种新型功能性油脂[4-5]。火麻籽榨油后得到大量的火麻籽粕，其富含的火麻蛋白含有多种人体必须氨基酸，是一种优质植物蛋白质[6]。Shen等[7]研究表明体外模拟火麻蛋白消化率能够达到90% 左右，媲美大豆蛋白，其水解肽具有多种保健作用。

近年来，围绕火麻籽粕的研究主要集中于火麻蛋白提取和火麻蛋白产品开发[8-10]，鲜见有关火麻籽粕多酚提取及其抗氧化活性的报道。目前从植物中提取多酚方式多样，其中微波辅助提取是向原材料中加入适合溶剂并置于微波反应仪中，该技术利用了微波能的优势，与传统浸提方法相比具有耗时短、浸提液受热均匀、节省溶剂、操作简便等优点。本文以火麻籽粕为原料，采用微波辅助提取技术结合响应面模型分析，考察乙醇体积分数、微波功率、微波时间对火麻籽粕多酚提取量的影响，并评价其抗氧化活性，旨在为火麻籽粕资源的开发利用以及火麻籽粕多酚提取物作为天然食品抗氧化剂的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火麻籽粕：市售；没食子酸、铁氰化钾、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、L-抗坏血酸（VC）（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、三氯乙酸（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；石油醚、无水碳酸钠、水杨酸、七水合硫酸亚铁、盐酸、30% 过氧化氢（分析纯）：四川西陇科学股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）（纯度>98% ）、福林酚试剂（生物试剂）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

多功能粉碎机（FW-135）：天津市泰斯特仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-9600）：北京瑞利分析仪器有限公司；电脑微波催化合成/萃取仪（XH-100B）：北京祥鹄科技发展有限公司；电子分析天平（FA2004）：上海舜宇横平科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-GF101-3BS）：上海跃进医疗器械有限公司；循环水多用真空泵（SHZ-D（Ш））：巩义市科瑞仪器有限公司；旋转蒸发仪（R-1001VN）：郑州长城科工贸有限公司；台式低速自动平衡离心机（TDZ4-WS）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 火麻籽粕粉末的制备流程

火麻籽粕除杂→恒温烘箱（45℃）烘干至恒重→粉碎过80目筛→石油醚中回流脱脂（50℃）→过滤收集滤渣→再次恒温干燥至恒重（45℃）→粉碎过80目筛→密封后干燥储存备用。

1.3.2 火麻籽粕多酚的测定

1.3.2.1 没食子酸标准曲线的绘制

准确配制0.1 mg/mL没食子酸标准溶液（准确称量没食子酸25 mg，蒸馏水溶解定容至250 mL），分别移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 上述标准溶液于10 mL具塞比色管，加入1.0 mL福林酚显色剂，静置显色反应6 min后，加入2.0 mL 7.5% 碳酸钠溶液，定容后避光反应2 h，以空白试剂为参比溶液，在765 nm波长处测定其吸光度，得到标准曲线回归方程为A＝128.89C-0.037 9（R2＝0.999 5），式中：A 为没食子酸吸光度；C为没食子酸质量浓度，mg/mL。

1.3.2.2 火麻籽粕多酚含量的测定

准确称取1.0 g脱脂后火麻籽粕粉末于磨口锥形瓶中，加入适量的乙醇溶液，然后将其置于微波合成仪中，连上冷凝管，进行微波提取，之后去除滤渣将滤液定容至100 mL，即得到火麻籽粕多酚提取液。准确移取0.8 mL上述提取液，按1.3.2.1显色方法测定其吸光度。按下式计算火麻籽粕多酚提取量。

式中：ρ为提取液中多酚质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；M为火麻籽粕粉末质量，g。

1.3.3 单因素试验设计

其它试验条件固定情况下，分别探究不同乙醇体积分数（30% 、40% 、50% 、60% 、70% ）、 不同微波功率（200、300、400、500 、600 W）、不同微波时间（1、2、3、4、5 min）、不同微波温度（40、50、60、70、80 ℃）、不同液料比[30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）]下火麻籽粕多酚的提取量，确定最佳单因素工艺条件。

1.3.4 响应面优化试验设计

对上述单因素试验结果进行方差分析，根据方差分析结果中F值大小挑选出3个较大影响因素，分别为乙醇体积分数（A）、微波功率（B）、微波时间（C），以火麻籽粕多酚为评价指标设计响应面试验，确定最佳火麻籽粕多酚提取工艺条件。响应面试验设计因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 火麻籽粕多酚抗氧化活性测定

以火麻籽粕多酚对DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、铁离子还原能力来评价其抗氧化活性，分别参考秦晶晶等[11]、谢佳函等[12]、裴斐等[13]、黎克纯等[14]方法进行测定，并以L-抗坏血酸溶液作为对照。

1.4 数据处理

以上所有试验均重复3次，采用SPSS 19.0对单因素数据进行方差分析，采用Origin 2018对单因素和抗氧化试验绘图，采用Design-Expert 8.0.6设计响应面试验并对试验结果进行回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数的确定

不同乙醇体积分数下火麻籽粕多酚的提取量见图1。

图1 不同乙醇体积分数下多酚的提取量Fig.1 The polyphenols extraction amount under different ethanol volume fraction

由图1可知，火麻籽粕多酚提取量在乙醇体积分数为60% 时达到峰值，为5.24 mg/g，原因可能是乙醇体积分数为60% 时，提取液极性接近于火麻籽粕中多酚极性，根据相似相溶原理，多酚在此浓度乙醇溶液中溶解度最大，因而提取量最大。当乙醇体积分数超过60% 后，多酚提取量下降较为显著（P＜0.05），原因主要是当乙醇体积分数过大时，由于溶剂极性降低导致植物蛋白质变性，使植物细胞中多酚类物质向提取液中的扩散阻力增大，因而提取量显著下降[15]。因此，响应面优化试验的乙醇体积分数选择50% 、60% 、70% 。

2.1.2 微波功率的确定

不同微波功率下火麻籽粕多酚的提取量见图2。

图2 不同微波功率下多酚的提取量Fig.2 The polyphenols extraction amount under different microwave power

由图2可知，随着微波功率由200W增大至300W，火麻籽粕多酚提取量显著增大（P＜0.05）；在300 W时提取量达到峰值，为5.69 mg/g；之后继续增大微波功率多酚提取量开始降低。这可能是由于增大微波功率会使火麻籽粕细胞内分子振动加快，分子间碰撞增多，因而导致多酚溶出增多，但过大的微波功率可能会破坏多酚分子结构[16]。微波功率在400 W～600 W时，多酚提取量差异不再显著（P＞0.05）。因此，响应面优化试验的微波功率选择200、300、400 W。

2.1.3 微波时间的确定

不同微波时间下火麻籽粕多酚的提取量见图3。

图3 不同微波时间下多酚的提取量Fig.3 The polyphenols extraction amount under different microwave time

由图3可知，随着微波时间的不断延长火麻籽粕多酚提取量增大较为显著（P＜0.05）；提取量在微波时间为3 min时达到峰值，为5.68 mg/g；当微波时间超过3 min后，火麻籽粕多酚提取量开始逐步减少（P＜0.05）。原因可能是微波时间过短，火麻籽粕细胞中多酚溶出不完全；微波时间过长，细胞中其他醇溶性杂质溶出增多，且长时间的微波处理可能会破坏某些多酚类化合物的分子结构[17]。因此，响应面优化试验的微波提取时间选择 2、3、4 min。

2.1.4 微波温度的确定

不同微波温度下火麻籽粕多酚的提取量见图4。

图4 不同微波温度下多酚的提取量Fig.4 The polyphenols extraction amount under different microwave temperature

由图4可知，微波温度在40℃～80℃时，对火麻籽粕多酚提取量的影响不太明显；微波温度在50℃时，多酚提取量达到峰值，为5.72 mg/g；微波温度超过50℃后，多酚提取量开始缓慢降低。这可能是因为火麻籽粕中某些多酚类化合物稳定性受温度影响敏感，较高温度下容易被分解，导致多酚提取量不升反降[18]。因此，响应面优化试验的微波温度选择50℃。

2.1.5 液料比的确定

不同液料比条件下火麻籽粕多酚的提取量见图5。

图5 不同液料比下多酚的提取量Fig.5 The polyphenols extraction amount under different liquidmaterial ratio

由图5可知，在一定液料比范围内火麻籽粕多酚提取量随着液料比的不断加大呈现显著增大趋势（P＜0.05）；多酚提取量在液料比为 50∶1（mL/g）时达到峰值，为5.84 mg/g；之后继续增大液料比，火麻籽粕多酚提取量逐步减少（P＜0.05）。原因主要是液料比较小时，火麻籽粕粉末与提取液接触不够充分，固液间传质动力较小，影响细胞中多酚类物质的溶出[19-20]；液料比为50∶1（mL/g）时，火麻籽粕多酚已基本溶出完全，继续增大提取液体积不仅导致溶剂浪费，还会增大某些醇溶性杂质的溶解，影响火麻籽粕多酚的提取。因此，响应面优化试验的液料比选择50∶1（mL/g）。

2.2 响应面工艺优化

2.2.1 回归模型建立及显著性检验

响应面优化火麻籽粕多酚提取工艺试验结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 The analysis results of response surface experiment

采用Design expert 8.0.6软件对表2数据进行回归分析，得出火麻籽粕多酚提取量（Y）与乙醇体积分数（A）、微波功率（B）、微波时间（C）3个自变量因素之间的二次多项式回归方程：Y=5.87-0.064A+0.016B+0.030C+0.017AB-0.025AC+0.045BC-0.17A2-0.11B2-0.088C2，回归方程方差分析结果见表3。

表3 回归方程方差分析结果Table 3 The results of regression equation variance analysis

由表3中方差分析结果可知，该模型F值为118.82、P＜0.000 1，模型差异极显著，失拟项 P=0.829 6＞0.05，差异不显著，说明所建模型受其他因素影响较小，回归方程能较好的预测出火麻籽粕多酚提取量；相关系数R2=0.993 5，说明在所选试验范围内真实值与预测值拟合良好。从F值大小可以得出，各因素对火麻籽粕多酚提取量的影响由大到小依次为A＞C＞B。其中一次项 A、C、交互作用项 BC、二次项 A2、B2、C2对火麻籽粕多酚提取量有极显著影响（P＜0.01），一次项B、交互作用项AC有显著影响（P＜0.05），交互作用项AB无显著性影响（P＞0.05），由此看出火麻籽粕多酚提取量与各因素间不是单纯线性关系。

2.2.2 响应面试验各因素间交互作用分析

在响应面三维立体图和等高线图中，某因素方向响应面陡峭说明其对多酚提取量影响较大，反之则影响较小；等高线呈椭圆，说明因素间交互作用明显，反之则交互作用不明显[21-22]。响应面试验各因素间交互作用分析结果见图6。

图6 各因素响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of various factors

由图6所示，各响应面曲面开口向下且曲面上均存在最大响应值。A（乙醇体积分数）曲面较其他因素曲面陡峭，说明3个因素中A因素对火麻籽粕多酚提取量影响最明显。交互项AC、BC等高线呈椭圆形，说明乙醇体积分数和微波时间、微波功率和微波时间交互作用显著；交互项AB等高线接近圆形，说明乙醇体积分数和微波功率交互作用不显著。

2.2.3 验证试验

由回归模拟方程得出火麻籽粕多酚最优提取工艺参数为乙醇体积分数58.02% ，微波功率310.99 W、微波时间3.23 min，此时火麻籽粕多酚提取量的预测值为5.88 mg/g。实际操作过程中结合试验操作便利性，设定乙醇体积分数58% 、微波功率311 W、微波时间 3.2 min，同时，固定最优液料比 50∶1（mL/g）、微波温度50℃，重复3次验证试验得出火麻籽粕多酚实际提取量为5.86 mg/g，与理论提取量相对误差仅为0.34% ，说明模型拟合良好，工艺可靠。

2.3 火麻籽粕多酚抗氧化试验结果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

火麻籽粕多酚和VC对DPPH自由基的清除能力见图7。

图7 火麻籽粕多酚和VC对DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH radicals by polyphenols from hemp seed meal and VC

如图7所示，在0.003 mg/mL～0.03 mg/mL浓度范围内，火麻籽粕多酚对DPPH自由基的清除率随着溶液浓度的增大而明显增大；在0.03 mg/mL～0.05 mg/mL浓度范围之间，火麻籽粕多酚的清除率逐步趋于平稳；溶液浓度为0.05 mg/mL时，火麻籽粕多酚和VC对DPPH自由基的清除率分别为94.63% 、74.57% ，经计算得出二者的半数抑制浓度（IC50值）分别为0.012、0.033 mg/mL，表明此浓度范围内，火麻籽粕多酚对DPPH自由基有较强的清除能力，且清除效果优于VC。

2.3.2 羟基自由基清除能力

火麻籽粕多酚和VC对羟基自由基的清除能力见图8。

图8 火麻籽粕多酚和VC对羟基自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of hydroxyl radicals by polyphenols from hemp seed meal and VC

如图8所示，在0.02 mg/mL～0.2 mg/mL浓度范围内，随着火麻籽粕多酚浓度的增大，其对羟基自由基的清除能力明显增强；溶液浓度为0.2 mg/mL时，火麻籽粕多酚和VC对羟基自由基的清除率分别为94.93% 、20.10% ，经计算得出二者的IC50值分别为0.080、0.33 mg/mL，表明火麻籽粕多酚清除羟基自由基的能力远大于VC。

2.3.3 超氧阴离子自由基清除能力

火麻籽粕多酚和VC对超氧阴离子自由基的清除能力见图9。

图9 火麻籽粕多酚和VC对超氧阴离子自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of superoxide anion radicals by polyphenols from hemp seed meal and VC

如图9所示，在0.02 mg/mL～0.20 mg/mL浓度范围内，火麻籽粕多酚对超氧阴离子自由基清除能力随其浓度的增大而明显增强，而当浓度大于0.20 mg/mL后，清除能力增强不再明显；相同浓度范围内，VC的清除能力增强相对缓慢，清除效果明显低于同浓度火麻籽粕多酚。火麻籽粕多酚对超氧阴离子自由基清除率的IC50值为0.10 mg/mL，表明火麻籽粕多酚对超氧阴离子自由基有较强的清除能力。

2.3.4 铁离子还原能力

火麻籽粕多酚和VC对铁离子还原能力见图10。

图10 火麻籽粕多酚和VC对铁离子还原能力Fig.10 Ferric reducing ability of polyphenols from hemp seed meal and VC

如图10所示，随着火麻籽粕多酚浓度的增大，其对铁离子的还原能力明显增强，且火麻籽粕多酚还原能力整体高于VC。在0.02 mg/mL～0.23 mg/mL浓度范围内，将溶液浓度（Y）和还原能力（X）线性拟合，得出火麻籽粕多酚和VC的拟合方程分别为Y1=6.469X1+0.165 6（R2=0.979 4）、Y2=6.690X2+0.030 2（R2=0.992 3）。表明火麻籽粕多酚和VC对铁离子的还原能力在一定浓度范围内呈现良好线性正相关，火麻籽粕多酚还原能力大于VC。

3 结论

以广西巴马地区火麻籽粕为原材料，采用微波辅助法并运用响应面模型进一步优化火麻籽粕中多酚的提取工艺。在最优工艺参数乙醇体积分数58% 、微波功率311 W、微波时间3.2 min、微波温度50℃、液料比50∶1（mL/g）条件下，火麻籽粕多酚实际提取量为5.86 mg/g，与理论提取量相对误差仅为0.34% 。火麻籽粕多酚对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有较强的清除能力，IC50值分别为0.012、0.080、0.10 mg/mL，清除能力大于VC；同时还具有较强的还原能力。抗氧化试验结果表明：火麻籽粕多酚具有较强的抗氧化能力，可作为天然抗氧化剂应用于食品领域。