基于网络药理学探讨肝积汤治疗肝癌的分子机制

吴辉渊

（江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

根据国家癌症中心2022年2月统计报告显示，我国2016年新发肝癌38.9 万例（约占总新发癌症的9.6%），以肝癌为主要死因的病例数为33.6 万例（约占癌症总死亡数的13.9%），其发病率和死亡率在全部类别的恶性肿瘤中分别居第4 位与第2 位[1]。治疗肝癌的主要手段包括外科手术、介入、靶向、免疫治疗等，仍存在术后复发率高、生存期短、不良反应严重等问题[2～3]。中医治疗肝癌有独特的疗效和丰富的经验[4～5]。肝积汤是医院以柔肝、健脾、散结为治法的经验方，前期临床研究显示肝积汤在中晚期肝癌患者的治疗中取得了良好效果，能有效延缓肝癌进展，改善患者生存质量，延长生存期，但具体分子机制未明[6]。网络药理学是利用计算机生物分析软件及数据库，从分子水平上系统揭示中药作用分子机制的方法[7]。其系统分析方法与中医整体观念下的辨证论治不谋而合。本研究拟采用网络药理学和生物信息学方法分析肝积汤治疗肝癌的机制。现报道如下：

1 工具与方法

1.1 肝积汤活性成分及作用靶点筛选 将肝积汤的组成药物柴胡、茯苓、夏枯草、茵陈、猪苓、女贞子、旱莲草、白术、半夏、白芍、青蒿、山楂作为关键词输入TCMSP 数据库，以OB≥30%并且DL≥0.18 为标准进行筛选，选取中药活性成分和靶点蛋白。利用Uniprot 对获取的靶点蛋白进行标准化处理，设置物种来源为“Human”，选择“Reviewed”，得到与靶点蛋白相应的标准基因。

1.2 肝积汤治疗肝癌的潜在靶点筛选 从GeneCards 数据库以“hepatocellular carcinoma”为关键词检索肝癌相关靶点。设定Relevance Score≥10。利用Venny2.1.0 对肝积汤活性成分靶点和肝癌相关靶点取交集。得到肝积汤治疗肝癌的潜在靶点。

1.3 PPI 拓扑分析 将1.2 得到的肝积汤治疗肝癌的潜在靶点导入 String 数据库中，设置为“Homo sapiens”，并且highest confidence≥0.40，其他设置为String 系统默认值，去除和其他蛋白无相互作用的蛋白，得到PPI 网络模型。结果以TSV 格式保存，导入Cytoscape3.8.2 分析作图，获得这些靶点蛋白质相互作用网络图。利用Network Analyzer 进行拓扑分析，通过筛选Degree 前15 位基因为核心靶点。

1.4 GO 和KEGG 通路富集分析 基于R 软件使用Bioconductor 生物信息软件包以Pvalue＜0.05，Qvalue＜0.05 进行GO 与KEGG 分析，以条形图或气泡图的形式展示结果。

1.5 绘制“成分-靶点-通路”网络图 将有效活性成分、作用靶点与KEGG 信号通路之间的关系导入Cytoscape3.8.2 软件进行可视化展示，形成“成分-靶点-通路”网络图，使用Network Analyzer 计算Degree，药物活性成分、靶点和KEGG 信号通路的Degree 越大越重要。

2 结果

2.1 肝积汤活性成分和靶点 在TCMSP 数据库中以OB≥30%、DL≥0.18 为条件筛选肝积汤各成分，去除无预测靶点的中药成分，得到中药成分有夏枯草11个、白术7个、柴胡17个、茵陈13个、猪苓11个、茯苓15个、女贞子13个、旱莲草10个、半夏13个、白芍13个、青蒿22个、山楂6个。将得到的中药成分合并去重，最终得到80个化合物和249个靶点。

2.2 肝积汤治疗肝癌的潜在靶点 通过GeneCards数据库中检索得到肝癌相关靶点885个。将肝积汤活性成分对应的249个靶点和肝癌相关的885个靶点合并去重，得到95个肝积汤治疗肝癌的潜在靶点。见图1。

图1 韦恩图

2.3 PPI 网络构建 将95个潜在靶点导入String数据库，并将结果导入Cytoscape 软件进行可视化展示。见图2。拓扑参数结果显示：Degree 排前15 位的蛋白有TP53、血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）、蛋白激酶B1（AKT1）、MYC、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB 抑制剂α（NFKBIA）、过氧化物合酶2（PTGS2）、FOS、BCL2L1、胱天蛋白酶8（CASP8）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、表皮生长因子受体（EGFR）、趋化因子配体8（CXCL8）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），所有这些靶点的Degree 均超过平均值，这些蛋白很可能是肝积汤治疗肝癌的核心靶点。

图2 肝积汤治疗肝癌PPI 靶点图

2.4 肝积汤治疗肝癌潜在靶点GO 富集分析 将潜在靶点经R 语言运行后GO 分析选取细胞组分（CC）、生物学过程（BP）和分子功能（MF）。GO 结果显示，潜在靶点基因共富集至2 215 条生物过程通路中，37 条CC 表达过程中，128个与分子功能相关的过程中。以基因数（Genecount）排序，并选前10 条进行绘图。结果显示主要的BP 涉及细胞对化学应激的反应、细胞对氧化应激的反应、对脂多糖反应等；CC 主要涉及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白络氨酸激酶等；MF 主要涉及DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合等。见图3。

图3 GO 富集分析

2.5 肝积汤治疗肝癌的KEGG 通路分析 利用R语言运行潜在靶点，得到KEGG 通路159 条，以气泡图的形式展示前20 的结果，Pvalue 代表富集的显著性，以颜色表示显著性的高低，越红显著性越高。结果发现，与肝癌相关的通路上有显著富集，如磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、乙型肝炎病毒信号通路、人巨细胞病毒（CMV）感染等信号通路。见图4。

图4 KEGG 通路分析

2.6 构建 “成分-靶点-通路网络” 并分析 利用Cytoscape3.8.2 软件构建“成分-靶点-通路”网络图，节点的拓扑参数使用Network Analyzer 功能进行分析。将KEGG 富集分析结果中排名前二十的通路及相关成分靶点导入Cytoscape 软件中，绘制出“成分-靶点-通路”网络图。见图5。图中圆形代表通路，方形代表靶点，三角形代表成分，节点大小根据节点度值大小变化。图中共165个节点，851 条边，其中66个成分节点，20个通路节点，79个靶点节点。其中槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）Degree 值排名中药成分前三，Degree 值分别为58、35、21。这3个成分涉及的靶点数目最多，很可能是肝积汤治疗肝癌的主要活性物质，分别来自夏枯草、女贞子、柴胡、青蒿、墨旱莲、山楂、白芍、茵陈。见图6。这些成分同时又通过TP53、VEGFA、AKT1 等多个靶点，共同作用于PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎病毒信号通路、CMV 感染信号通路等多条信号通路。

图5 “成分-靶点-通路”网络图

图6 活性成分与中药网络图

3 讨论

通过运用网络药理学的研究方法，本研究探索了肝积汤治疗肝癌患者可能的活性成分、靶点和通路。通过“成分-靶点-通路”网络图显示，Degree 值排名靠前的中药活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，这些成分可能是肝积汤治疗肝癌的主要活性成分。槲皮素是广泛存在自然界多种植物的黄酮类多酚物质，有抑制肝癌细胞生长[8]、抗癌细胞侵袭转移[9]、抗血管生成[10]及化疗增敏作用[11]，木犀草素、山柰酚同样有抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡、抗血管生成及化疗增敏作用[12～16]。

通过构建PPI 网络可知，TP53、VEGFA、AKT1可能是肝积汤方作用于肝癌最为关键的靶点。TP53作为一种多功能转录因子，大多数肿瘤发生了TP53基因突变，是目前常见的抑癌基因[17]。TP53 表达水平与肝癌患者总生存期相关，高表达患者预后差，无TP53 基因突变的肝癌患者预后好[18]。VEGFA 参与多种恶性肿瘤的侵袭、增殖和转移过程，是目前最重要的促进血管生成的因子[19]。肝癌中VEGFA 高表达患者的无进展生存期、总生存期较VEGFA 低表达患者缩短[20]。中药可下调VEGFA 的表达从而抑制血管生成[21]。

本研究KEGG 富集分析显示，肝积汤治疗肝癌主要涉及PI3K-Akt、乙型肝炎病毒、CMV 感染等信号通路。其中，PI3K-Akt 信号通路可促进细胞增殖和侵袭，对肝癌的发病和进展有着非常重要的作用，PI3K-Akt 信号通路受抑制后可以降低肝癌细胞迁移和侵袭[22]，PI3K-Akt 信号通路也可以被槲皮素抑制从而诱导肝癌细胞凋亡[23]。木犀草素可以通过PI3K-Akt 通路抑制促进细胞凋亡[24]。山柰酚抑制PI3K-Akt-ERK 等信号通路降低多种肿瘤的增殖和侵袭[25]。乙型肝炎病毒可以通过多个途径导致肝癌的发生[26]，在我国大部分原发性肝癌患者既往有慢性乙肝病毒感染史，通过抑制慢性乙肝病毒，阻断肝细胞癌变，成为原发性肝癌临床治疗的重要方法。CMV 感染可能是肝癌的主要危险因素，Faivre 等[27]发现CMV 血清阳性的肝癌患者更易出现远处转移，CMV 感染与肝细胞癌死亡率有一定关联。

本研究发现的槲皮素、木犀草素、山柰酚等作用于TP53、VEGFA、AKT1 等靶点，通过PI3K-Akt、乙型肝炎病毒等通路发挥治疗肝癌的作用，与目前该领域研究得出的结果有一定的相似性[28]。槲皮素、山柰酚等存在于多种中药特别是治疗肝癌的中药处方中，具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫等多种药理作用，目前研究较充分，从某种程度上也说明中药治疗肝癌在理论上的合理性和临床上的有效性，同时也提示了网络药理学的局限性。前期临床研究证明肝积汤临床疗效确切，安全性好。本研究发现肝积汤的作用机理复杂，有多种活性物质通过多个通路和靶点起效，这与中药整体思路相符合。下一步将通过全面科学的实验研究证实。