白茶对秀丽隐杆线虫抗氧化损伤和抗衰老作用研究

李　慕

白茶对秀丽隐杆线虫抗氧化损伤和抗衰老作用研究

李慕

（邵阳学院湖南邵阳422000）

文章选取秀丽隐杆线虫为实验模型，采用白毫银针（Baihaoyinzhen, YZ）、白牡丹（Baimudan, MD）和寿眉（Shoumei, SM）来比较不同原料来源白茶的体内抗氧化和抗衰老作用。实验结果显示，3种白茶在百草枯诱导的急性氧化应激秀丽隐杆线虫模型中，均表现出良好的抗氧化、抗衰老作用。在寿命和体内抗氧化酶含量测定实验中，3种类型的白茶测试的浓度中均以1 000 mg/L的浓度效果最佳，并且在该浓度下，白毫银针的抗氧化作用明显强于白牡丹和寿眉，而白牡丹与寿眉无明显差异。在分子水平上，白茶提取物的抗氧化损伤和抗衰老作用依赖于经典的Insulin/IGF-1信号途径。

白茶；百草枯；抗氧化损伤；抗衰老

如何延长生物寿命、延缓衰老，一直是科研工作者关注的热点问题。衰老是一个十分复杂的过程，由于科研工作者观察角度、研究方法的不同，关于衰老机制的学说也不尽相同。其中衰老的自由基学说认可度较高，其认为氧气进入生物体后会转变为活性氧自由基，过量的自由基会导致机体内氧化损伤的累积，从而导致机体衰老[1]。而生物体内所含的抗氧化酶体系及外部摄入饮食中所含的抗氧化活性物质能够通过终止自由基反应，减少自由基的产生并增长个体的寿命[2-3]。秀丽隐杆线虫的生命周期短，培养条件简单、易于操作，且具备完备的发育和解剖学特征及复杂的遗传学特征。其抗氧化及抗衰老相关基因与人类高度同源，使其成为在衰老研究领域中国际公认首选的模式生物。

白茶是我国传统的六大茶类之一，有研究证明，白茶具有良好的抗突变、抗癌、抗氧化效果，并且在神经保护、预防糖尿病及生殖健康等方面有诸多效果[4]。但有关白茶的抗氧化损伤研究多数是体外实验[5]，体内功能实验较为缺乏。利用秀丽隐杆线虫作为模式生物，体内研究白茶的抗氧化损伤、抗衰老功能以及分子机制少有报道。因采摘和制作工艺的不同，造成不同种类白茶含有的化学活性物质存在较大的差异，其抗氧化和抗衰老效果也可能会有所不同。本研究选取3种代表性白茶（白毫银针、白牡丹和寿眉）为研究对象，以秀丽隐杆线虫为动物模型，旨在探讨不同白茶提取物的抗氧化和抗衰老效果的差异和分子机制，为白茶促进人体健康，延缓人体衰老的保健功效提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与实验动物

实验选取白茶为2018年白毫银针（Baihaoyinzhen, YZ）、2018年白牡丹（Baimudan, MD）、2018年寿眉（Shoumei, SM），制于福建福鼎。

白茶提取物制备过程：取200 g白茶叶进行粉碎，过200目筛，获得白茶干粉；白茶干粉加入2 500 mL 50 ℃～60 ℃的纯净水中，搅拌均匀，加入植物水解酶，在超声波辅助下酶解4 h～6 h，灭酶，经过高速离心取上清液，即得提取液；通过超滤膜对提取液进行过滤，对于不同提取物选择相应温度进行真空浓缩，并干燥、储存。

实验动物为秀丽隐杆线虫N2品系、GA186突变型品系。

1.2 实验方法

1.2.1 秀丽隐杆线虫寿命实验

秀丽隐杆线虫寿命实验分为非氧化应激组和氧化应激组两大组（各3个平行），每个大组里又分3个白茶提取液处理组（处理浓度分别为100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L）以及1个空白对照组（0 mg/L）。将野生型（N2品系）同步化的秀丽隐杆线虫在不同浓度的3种白茶提取液培养皿中培养至L2时期后，非氧化应激组不做氧化应激处理，氧化应激组使用2 mM百草枯进行氧化应激处理。各组的每个培养皿上20条～25条成虫，定期转板，非氧化应激组24 h记录一次线虫死亡数目，百草枯氧化应激组12 h记录一次，在进行寿命统计时，以线虫L2时期为记录起始时间。

1.2.2 氧化应激组脂褐素分析实验

选取存活率为20％的线虫，NaN3麻醉后制片，在倒置荧光显微镜（参数为激发340 nm～380 nm，发射430 nm）下拍摄线虫脂褐素荧光图片，使用ImageJ软件分析脂褐素荧光水平，并绘图。

1.2.3 氧化应激组秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶含量分析

各组线虫处理培养5 d后进行收集，平均分配后，每管大约500条成虫，进行洗涤超声破碎离心取上清液，根据SOD测定试剂盒的操作步骤来测定相关抗氧化酶含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，以均值±标准误差表示；组间均值比较采用单因素方差分析，*表示＜0.05，差异显著，**表示＜0.01，差异极显著。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 白茶提取物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

在非氧化应激组中，不同种类白茶提取液各浓度处理后线虫的平均寿命如表1所示。3种白茶的3种浓度提取液处理组与空白对照组对比，平均寿命经过统计分析均无显著性差异，说明在非急性氧化应激状态下，在本实验设定浓度范围内，白茶提取液对秀丽隐杆线虫的寿命没有显著性影响。

在百草枯处理的氧化应激组中，不同种类白茶提取液各浓度处理后线虫的平均寿命如表2所示。白茶的3种浓度提取液处理组线虫的平均寿命相比空白对照组有显著的延长，其中白毫银针组效果最为显著，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L浓度下分别延长了19.3％、24.8％和31.8％。寿眉组与白牡丹组相比，线虫的平均寿命没有显著性差异，延长寿命效果略差于白毫银针组。实验表明，在百草枯诱导的急性氧化应激组中，不同种类白茶提取液均对秀丽隐杆线虫有保护作用，能够提高秀丽隐杆线虫氧化应激抵抗力，并且在测试的不同浓度中，1 000 mg/L浓度的效果最好。

表1不同浓度白茶处理后线虫（非氧化应激组）的平均寿命统计（单位：d）

白茶类型提取液浓度/mg/L01005001 000 YZ20.09±1.1220.31±1.2320.46±1.0520.39±0.95 SM20.09±1.1220.01±1.1520.20±1.0520.30±1.22 MD20.09±1.1218.98±1.0320.23±1.2120.33±1.02

表2不同浓度白茶处理后线虫（氧化应激组）的平均寿命统计（单位：d）

白茶类型提取液浓度/mg/L01005001 000 YZ3.11±0.853.71±0.95*3.88±0.98*4.10±0.90** SM3.11±0.853.41±1.10*3.52±1.15*3.67±1.08* MD3.11±0.853.39±1.03*3.49±1.13*3.63±1.02*

注：*代表与空白对照组相比，＜0.05；**代表与空白对照组相比，＜0.01。

2.2 白茶提取物对秀丽隐杆线虫脂褐素的影响

图1　3种白茶提取物对野生型（N2）秀丽隐杆线虫脂褐素的影响比较（氧化应激组）

大部分生物在衰老的过程中，细胞内的溶酶体自噬后，未被消化的化合物和一些脂质会聚集在一起形成脂褐素，这种现象在秀丽隐杆线虫中也存在。脂褐素可以自发荧光，可以通过荧光显微镜进行观察。生物越是衰老，脂褐素浓度越高，可以观察到的荧光强度越强，因此脂褐素荧光强度可以作为评价线虫衰老程度的重要指标[6]。

百草枯诱导的急性氧化应激组中，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L的处理浓度下，白毫银针组的脂褐素含量对比空白对照组分别下降了10.2％、14.1％和21.3％，寿眉组的脂褐素含量对比空白对照组分别下降了7.3％、10.2％和16.8％，白牡丹组的脂褐素含量对比空白对照组分别下降了6.9％、9.4％和15.7％。如图1所示，3种白茶提取液的3个浓度处理下的脂褐素积累相比空白对照组均有下降，其中白毫银针组效果最为显著，寿眉组与白牡丹组没有显著差异。由此可知，脂褐素积累的下降趋势和寿命延长的趋势基本吻合。

2.3 白茶提取物对秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶含量的影响

细胞内过量的氧自由基、MDA、自由基和脂质氧化反应产物会导致细胞膜损伤，引起细胞衰老，而抗氧化酶（SOD）可以抑制这些物质对细胞的氧化损伤作用，因此，通过测定其活性可以评估生物的抗氧化损伤能力。鉴于在1 000 mg/L的浓度下，3种白茶提取液在对氧化应激组线虫延长寿命和抑制脂褐素积累上效果最佳，本次实验对象为氧化应激处理后的N2品系秀丽隐杆线虫，3种白茶提取液浓度为1 000 mg/L，空白对照组浓度为0 mg/L。结果显示，在急性氧化应激条件下，与空白对照组相比，白毫银针组、寿眉组和白牡丹组线虫体内SOD含量分别提高了61.1％、40.6％和35.3％（见图2），说明白茶提取物可以提高线虫体内SOD的含量，增强其抗氧化损伤的能力。同时，白毫银针组提升效果高于寿眉组和白牡丹组，与前期寿命实验和脂褐素实验趋势相吻合，也进一步证实了线虫体内SOD活性、脂褐素积累情况与寿命之间存在高度相关性。

图2　白茶提取物对野生型（N2）线虫体内抗氧化酶含量的影响（氧化应激组）

2.4 白茶提取物对GA186品系秀丽隐杆线虫寿命的影响

图3　白茶提取物对GA186品系秀丽隐杆线虫寿命的影响

影响线虫寿命的最主要分子机制为Insulin/IGF-1信号途径，其关键性基因有。为了分析白茶提取物对处于急性氧化应激条件下的线虫的保护作用的分子机制是否与该经典途径相关，本实验选择GA186（基因型为sod-3(tm760)X）突变型线虫进行氧化应激实验，用浓度为1 000 mg/L的3种白茶提取液进行处理，测定其寿命。收集实验数据得出，空白对照组（0 mg/L）的平均寿命为2.88 d，白毫银针、寿眉和白牡丹实验组的平均寿命分别为2.77 d、2.83 d、2.70 d（见图3）。实验组与对照组线虫平均寿命无显著差异，说明白茶提取物的抗氧化损伤和抗衰老作用依赖于经典的Insulin/IGF-1信号途径。

3 结论

本研究结果表明，3种白茶提取物在急性氧化应激秀丽隐杆线虫模型中，表现出良好的抗氧化、抗衰老作用。3种类型的白茶提取液的测试浓度中，均以1 000 mg/L浓度的效果最佳，其中在相同提取液浓度条件下，白毫银针的抗氧化作用明显强于白牡丹和寿眉，而白牡丹与寿眉无明显差异。白茶提取物的主要成分为茶多酚、黄酮、咖啡因等物质，但是不能排除有极微量的小分子活性物质也在里面发挥着关键性的作用，所以本实验中并未对3种白茶提取物的主要化学成分进行测定分析。有相关文献报道，3种白茶的提取物中，白毫银针的茶多酚、总黄酮含量要高于寿眉和白牡丹，寿眉和白牡丹的相关成分含量差别不大，而茶多酚和黄酮类物质体外和体内抗氧化能力显著[7]，这从侧面揭示了白毫银针抗氧化、抗衰老作用明显强于白牡丹和寿眉的原因，但是也不能排除在不同类型白茶提取物中可能存在其他微量的活性物质在发挥着关键性作用。

在生化水平上，3种白茶提取物均能提高线虫体内SOD的含量，增强其抗氧化损伤的能力，延缓线虫衰老。而在分子水平上，白茶提取物的抗氧化损伤和抗衰老作用依赖于经典的Insulin/IGF-1信号途径。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.07.07

TS272.5

A

2095-1205(2022)07-20-03

湖南省教育厅一般项目“三种白茶的体内抗氧化损伤效果与机制研究”（18C0812）