木糖醇氨酸脱氧胆盐琼脂培养基在食品中沙门氏菌敏感度与特异性检验的实验研究

申国霞，宋 丽，常 鑫

(1.兰州职业技术学院，甘肃 兰州 730070；2.青岛铭家尚品餐饮管理有限公司，山东 青岛 266000)

沙门氏菌属属于常见食品污染菌，主要包含：鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)，肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)等十余种。且人工食品检疫过程对沙门氏菌有生态优选定向进化作用，导致沙门氏菌偏向不耐常规培养基的定向变异进化。即常规食品检测用培养基被大量使用后，沙门氏菌会对培养基产生不耐性，所以必须及时调整培养基组分，对抗沙门氏菌定向变异进化中对培养基产生的不耐性。

较长时间以来，琼脂培养基多作为沙门氏菌的检测用培养基。该研究测试包含木糖醇、赖氨酸、脱氧胆酸钠等组分的琼脂培养基，对比其与其他组分培养基的沙门氏菌不耐性表达。由于生物技术的不断发展，沙门氏菌的检测和鉴定技术也在不断地完善，常用的方法为：常规生化鉴定方法、免疫学方法和分子生物学方法。

沙门氏菌属专对性致病菌，有的沙门氏菌只对动物致病，也有的沙门氏菌对人和动物都致病。平时认为的沙门氏菌病就是指由各种类型的沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽引发不同形式病菌的总称。被感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染过食品，也可使人发生食物中毒现象。据相关统计，在全球的种类细菌性食物中毒中，因此需要我们根据沙门氏菌的形态学特征、培养特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌体特征等相关特征，进行沙门氏菌培养对食用检测用木糖醇氨酸脱氧胆盐琼脂培养基敏感度与特异性实验研究。

1 研制过程与实验方法

1.1 试剂的选择与制备

麦芽浸粉琼脂，上海阿拉丁生化；木糖醇，山东欧恩科化学；L-赖氨酸，上海国药；脱氧胆酸钠，上海尚宝生物；均为分析纯。

配方为(质量比)：麦芽浸粉琼脂48%，木糖醇42%，L-赖氨酸8%，脱氧胆酸钠2%；制剂储备含水量≤5%，实验含水量150%～165%；制备环境为三级生化无菌环境。

实验所有的水为软水或蒸馏水，符合GB/6682标准三级以上用水。蒸馏法是目前实验室中广泛采用的制备实验室用水的方法，将原料水加热蒸馏就得到蒸馏水。用离子交换树脂制备纯水的方法，有单床法、复床法及混合床法三种。单床法是只通过一种树脂，除去一种离子。如为了某种特殊用途，将蒸馏水通过阳离子交换树脂，即可得到不含金属阳离子的水。复床法是将阴离子与阳离子交换树脂串联起来，水中的阴、阳离子先后都被除去，得到高纯度的去离子水。

1.2 目标菌群的选择

该试剂设计目标菌群为：伤寒杆菌；甲型副伤寒杆菌；乙型副伤寒杆菌；丙型副伤寒杆菌；鼠伤寒杆菌；猪霍乱杆菌；肠炎杆菌；对上述7种常见沙门氏菌在该培养基中的不耐性表现，对比2个参照组培养基的不耐性表现，探讨该研究设计培养基敏感度与特异性的特征。

1.3 参照组设计

本次参照组A和参照组B的设计按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》GB/T 4789.4—2016标准执行，具体设计如下：

参照组A：牛肉膏琼脂培养基，配方为：牛肉膏0.3 g(分析纯，北京红润宝顺科技)，蛋白胨1.6 g(分析纯，北京红润宝顺科技)，氯化钠0.5 g(微米分析纯，西安锦源生物)，麦芽浸粉琼脂15.2 g(分析纯，上海阿拉丁生化)，水100 ml(电解分析纯，实验室自行提取)。

参照组B：乳糖胆盐琼脂培养基，配方为：乳糖1.3 g(分析纯，天津金玻化生物)，麦芽浸粉琼脂17.2 g(分析纯，上海阿拉丁生化)，氯化钠0.6 g(微米分析纯，西安锦源生物)，脱氧胆酸钠1.2 g(分析纯，上海尚宝生物)，水100 ml(电解分析纯，实验室自行提取)。

1.4 统计学方法

上述7种菌群，混合食用蛋白粉、食用淀粉等分别制成150、75、25、5 mg/kg浓汤混浊液，共28种，每种制备600份，每200份使用观察组(该研究设计的木糖醇氨酸脱氧胆盐琼脂培养基)、参照组A(牛肉膏琼脂培养基)、参照组B(乳糖胆盐琼脂培养基)进行24 h体温恒温培养，使用850倍光学电镜考察。

培养后，光学电镜下不可见标记培养皿为“-”，光学电镜下可见但肉眼不可见标记培养皿为“+”，肉眼可见但培养皿内覆盖面不高于20%标记培养皿为“++”，肉眼可见且培养皿内覆盖面高于20%标记培养皿为“+++”。统计上述28种各3组，共84组培养皿中“-/+/++/+++”标记产生的数量占比。

另外对3种培养基各设置200份无菌参照组，作为特异性观察依据。并使用SPSS大数据分析软件展开线性回归对二组数据进行分析，P<0.05具有一定的统计学意义。

2 培养基不耐性及特异性试验结果

根据上述实验设计进行相关培养实验，观察组、参照组A、参照组B在不同浓度不同人工培养含菌培养环境中的表现如表1所示。

由表1可见，7种含菌培养液致病菌种类分别为：第1类伤寒杆菌；伤寒杆菌是一种致病菌，主要存在于肠道当中，通过伤寒病人的排泄物传播，是较为严重的肠道传染病。第2类甲型副伤寒杆菌；属于肠道杆菌，一般可以通过日常的用水、食物、苍蝇、接触等进行传播，具有一定的传染性。第3类乙型副伤寒杆菌；是一种肠道的乙类传染性疾病，多发生在儿童。第4类丙型副伤寒杆菌；在自然条件下，副伤寒杆菌一般只能感染人类，仅偶而感染动物。第5类鼠伤寒杆菌；属多价O抗血清的B群，是一种临床较常见的沙门菌，鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌，其感染发病率居沙门菌感染的首位，多见于婴幼儿，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高。第6类猪霍乱杆菌；猪霍乱沙门氏菌是非伤寒沙门菌的一种，是引起仔猪副伤寒的主要病原菌。第7类肠炎杆菌；是一种细菌，能引起肠道的炎症和其他病变，一般在临床常常出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、稀水便或粘液脓血便等症状。按统计目标，所有含菌培养液混合培养基后，出现的“-”标记均为假阴性标记，观察组在5 mg/kg条件下的假阴性率为16.5%，在25 mg/kg条件下的假阴性率为5.5%，在75 mg/kg条件下的假阴性率为1.5%，在150 mg/kg条件下的假阴性率为0，2个参照组的假阴性率均显著高于观察组。为了比较二者的假阳性率，对比分析3种培养基在空白培养皿中上述7种致病菌的检出率，得到表2。

表1 不同菌群浓度在不同培养基中的表现

表2中，显示出空白培养皿中常见致病菌检测敏感度和特异性与对照组的相关差异，7种含菌培养液致病菌种类同表1，200份空白培养皿的合计结果中，观察组检出假阳性8个，占比为4.0%，参照组A检出假阳性52个，占比为26.0%，参照组B检出假阳性36个，占比为18.0%。其中观察组仅有标记为“+”的弱假阳性培养皿，而标记为“++”或“+++”的强假阳性培养皿中，参照组A为3.0%，参照组B为1.0%。

表2 空白培养皿中常见致病菌检出情况

3 培养基制备实验结果与结论

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

该实验制备的观察组培养基为木糖醇氨酸脱氧胆盐琼脂培养基，参照组A为牛肉膏琼脂培养基，参照组B为乳糖胆盐琼脂培养基。2个参照组培养基均为在食品沙门氏菌检测中的常用培养基。实验中重点分析了这3种培养基在不同致病菌浓度条件下的假阳性率和假阴性率，证实观察组培养基的假阳性率和假阴性率均显著低于2个参照组培养基。根据生物医学统计学范例，敏感度为真阳性率，即100%减去假阳性率，特异性为真阴性率，即100%减去假阴性率，所以，观察组培养基的敏感度和特异性均显著高于2个参照组。在150 mg/kg的人造污染食品混浊液的检测中，观察组培养基可以实现100%敏感度，其他2个参照组在此浓度条件下的敏感度分别为98.0%和98.5%。在5 mg/kg的人造污染食品混浊液的检测中，观察组培养基可以实现83.5%的敏感度，其他2个参照组在此浓度条件下的敏感度分别为51.5%和73.5%。上述2个参照组培养基在相关文献中表明，其最早推广应用时的敏感度和特异性远高于该实验实测值，即根据前文假设的定向变异进化体质，上述两种培养基有被新培养基取代的技术必要性。实验中配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH值调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌.如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。木糖醇氨酸脱氧胆盐琼脂培养基具有作为新型沙门氏菌培养基的技术可行性，不仅为免疫学中致病菌的快速检测提供了新方法，同时还大大提高了致病菌检测的灵敏性和特异性。