同位素稀释液相色谱-串联质谱法和量子点荧光免疫层析法快速测定谷物中呕吐毒素的比较研究

莫紫梅，袁光蔚，王海波，陈宁周，宁 芯，覃 思，何林飞

(1.广西-东盟食品检验检测中心，广西 南宁 530022; 2.玉林师范学院化学与食品科学学院，广西 玉林 537000)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又称为呕吐毒素，属B型单端孢霉烯族化合物，是镰刀菌属的菌种引起的谷物赤霉病的重要指示性毒素，会影响免疫细胞因子的分泌、抑制淋巴细胞增殖、具有吞噬作用和巨噬细胞的杀菌作用，有很强的免疫抑制作用，可以诱导免疫细胞凋亡，抑制其增殖[1-3]，人畜如果长期食用被DON污染的食物，会引起细胞毒性和神经毒性等，其危害直接影响到了人和家畜的健康安全[1-2]。呕吐毒素化学性质稳定，受热不易分解，通常存在于全球各地区的小麦、玉米和大麦等农作物中，是一种严重污染谷物的霉菌毒素，在作物加工、储存及食品烹调过程中不容易被破坏，对人类和动物健康构成很大威胁[3]。

目前测定呕吐毒素比较常用的检测方法有薄层色谱法[4-5]、亲和高效液相色谱法[6]。但这些分析方法在应用上有一定的局限性，具有耗时长、成本高等缺点，需要大型的仪器设备，无法在现场灵活使用[7-8]。近些年也出现了一些快速简便的DON检测方法，如聚合酶链反应(PCR)技术[6]、酶联免疫分析(ELISA)法[6-7]、光纤生物传感器技术[5]、胶体金免疫层析法[9-10]及免疫荧光技术[11-13]等。这些技术由于具有现场检验快速、简便的特点，特别适合于广大基层人员使用和大批量食品检测以及大面积地区普查，具有巨大的发展潜力和广阔的市场应用前景[14-15]。

免疫荧光技术是近年发展起来的新兴技术，拥有传统相关技术不可比拟的优势。但因为传统的荧光染料如异硫氰酸荧光素的激发光谱和发射光谱互相干扰严重，一定程度上限制了免疫荧光技术的应用范围。而荧光量子点(QDs)作近几年出现的新型荧光标记材料，因为其具有发射光谱范围窄且对称、Stokes位移大、背景噪声小等优点，致使其灵敏度和分辨率得到显著提高，并引起了各国研究者的极大关注[16-17]。荧光免疫层析定量检测技术是在免疫层析技术的基础上，利用荧光定量分析技术对标记物浓度进行检测的一种新方法[16]。使用荧光量子点作为荧光标记材料的荧光免疫层析定量检测技术，通过量子点标记呕吐毒素抗体与样品中的呕吐毒素结合，在毛细作用下向前层析，达到检测区后，检测线T线上固定的呕吐毒素抗原与剩余未结合的量子点标记呕吐毒素抗体结合。检测线T线上结合的量子点标记的呕吐毒素抗体的量与样品中呕吐毒素的浓度成反比，控制线C线结合的量子点荧光标记物与样品中呕吐毒素的浓度无关。层析结束后，采用 NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过标准曲线即可计算出样品中呕吐毒素的含量。

本试验采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法和NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪快速定量检测谷物中呕吐毒素的含量，通过2种方法的比较，确定量子点荧光免疫层析法检测谷物中呕吐毒素的可行性和可靠性，且该法操作简单，检测时间短，特异性良好，有望用于各地市场现场快速定量检测呕吐毒素，在公共食品安全等领域具有重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器与设备

QUINTIX313-ICEU电子天平,德国赛多利斯公司；RDTANA460R离心机,美国Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式涡旋振荡器,德国海道夫公司；NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪,江苏量点科技有限公司；Milli-Q 超纯水系统,美国Milli-pore 公司；EBA 270离心机,德国Hettich科学仪器公司；Shimadzu DGU-20A超高效液相色谱仪,日本岛津公司；AB QTRAP 4500 MS四极杆质谱仪(配电喷雾离子源),美国AB SCIEX公司。

1.1.2材料与试剂

DON稀释液B(20210101)；实验室用水为Milli-Q超纯水。甲醇、甲酸、乙酸、乙酸铵(色谱纯),默克股份公司；呕吐毒素标准溶液(100.10 μg/ml)、呕吐毒素免疫亲和柱，ROMER LABS有限公司。

1.2 方法

1.2.1量子点荧光免疫层析法

(1)样品前处理

玉米前处理：取20～30 g玉米样品于粉碎机中进行充分粉碎，可反复2～3次。将粉碎过的样品过20目(孔径0.85 mm)筛，收集过筛样品备用。称取过筛样品5 g置50 ml离心管中，加入55%甲醇溶液25 ml，混匀，旋涡震荡10 min，6 000 g离心3 min，收集上清液。取上清液100 μl，与稀释液B 400 μl振荡混匀，待上样检测。(注：个别检测样品如喷浆玉米皮、喷浆玉米胚芽粨、DDGS等呈酸性时，请微调pH值至6～8，调节pH值时注意总体积变化不要超过1%)。

小麦前处理：取20～30 g小麦样品于粉碎机中，进行充分粉碎，可反复2～3次。将粉碎过的样品过20目筛，收集过筛样品备用。称取过筛样品5 g置离心管中，加入纯水25 ml，混匀，旋涡震荡10 min，6 000 g离心5 min，收集上清液。取100 μl上清液，加入300 μl稀释液A，充分震荡2 min，待检。

(2)样品检测

将检测卡及待检样本取出，平衡至室温，开启NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪。将检测卡加样孔朝上平放，移取的待检样本75 μl垂直缓慢滴入检测卡的加样孔中，反应15 min，将检测卡插入 NepQD-Infinity-V1/P1快速荧光分析仪，并进行检测。

1.2.2高效液相-串联质谱法

(1)样品前处理

按GB 5009.111-2016[18]操作。称取 2 g(准确至 0.01 g)粉碎试样于50 ml离心管中，加入400 μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液(84+16)，置于涡旋振荡器振荡20 min，以10 000 r/min 离心5 min，收集上清液 于干净的容器中备用。

取 5 ml 上清液置于40～50 ℃下氮气吹干,加入2 ml 水充分溶解残渣，待呕吐毒素免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至玻璃注射器筒中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以每秒 1 滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5 ml PBS 缓冲盐溶液和5 ml水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1～2滴，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入 2 ml 甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入 1.0 ml 初始流动相,涡旋 30 s 溶解残留物，0.22 μ m 滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

(2)标准溶液的配制

呕吐毒素标准储备溶液(100 μ g/ml):分别称取 DON 1 mg(准确至 0.01 mg)，分别用乙腈溶解并定容至 10 ml。将溶液转移至试剂瓶中,在-20℃ 下密封保存，有效期 1 年。

标准工作溶液(10 μg/ml):准确吸取100 μg/ml DON标准储备液1.0 ml 于10 ml 容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20 ℃ 下密封保存，有效期半年。

同 位 素 内 标 工 作 液(1 μg/ml):准 确 吸 取13C15-DON同 位 素 内 标(25 μg/ml)1 ml于25 ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20 ℃下密封保存,有效期半年。

标准曲线溶液的配制：准确移取适量标准工作溶液和同位素内标工作液，用初始流动相配制成 10、20、40、80、160、320、640 ng/ml的混合标准系列,其中同位素内标浓度为100 ng/ml。标准系列溶液于4 ℃保存，有效期7 d。

(3)色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLCRBEH C18柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：40℃；流速：0.3 ml/min；进样量：10 μl；流动相：A 为水，B 为乙腈；采用梯度洗脱程序，见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

(4)质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：负离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压(IS)：5 500 V；离子源温度：550 ℃；curtain gas(气帘气)为35.0 psi；gas 1(雾化气)、gas2(辅助气)分别为50，50 psi。MRM相关参数设定见表2。

表2 呕吐毒素及其内标物的保留时间、定性离子、定量离子与内标物等MRM相关参数

2 结果

2.1 线性范围、检出限、回收率及精密度

同位素稀释高效液相色谱-串联质谱的标准工作曲线为：Y=3 064.7X+4 811.2，相关系数r=0.998 6，表明在浓度10～640 ng/ml时线性关系良好，检出限10.0 μg/kg。

量子点荧光免疫层析法采用NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪内置曲线，其线性方程为：Y2.020 2X+5.016 7，相关系数R2=0.999 7，其中Y=ln(p/q)，p=OD/OD0，q=1-p，式中X为ln(目标物浓度)，OD为目标物反应值，OD0为目标物浓度为0的反应值均值。量子点荧光免疫层析检测谷物中呕吐毒素的线性范围为25～5 000 μg/kg，检出限为25 μg/kg。

取阴性样品进行加标回收试验，设计3个不同水平，将呕吐毒素标准溶液添加到空白玉米粉样品中，混合均匀，按照1.2方法进行试验，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱和量子点荧光免疫层析法的回收率分别为92.9%～98.0%和85.5%～101.1%，精密度为1.3%～3.4%及0.4%～3.0%，见表3。根据 GB/T 27404—2008附录F[19]中的要求，回收率参考范围被测组分含量<0.1 mg/kg时，回收率范围在60%～120%；0.1～1 mg/kg时，回收率范围在80%～110%；1～100 mg/kg时，回收率范围在90%～110%；>100 mg/kg时，回收率范围在95%～105%，符合国标要求。

表3 2种检测方法线性方程、回收率、检出限比较

2.2 质控样及其精密度

采用2种方法对购买具有标准物质证书的质控样(特性值1 082.5 μg/kg，特性值区间1 029.2～1 135.8 μg/kg)进行测定。结果表明，同位素稀释高效液相-串联质谱法和量子点荧光免疫层次法的结果分别为1 106.7 μg/kg及1 048.2 μg/kg，均在特性值区间范围内，符合要求。且对样品进行6次独立重复测试，其相对标准偏差分别为1.9%和2.3%，精密度均符合定量分析的要求。见表4。

表4 2种检测方法质控样测定结果

2.3 灵敏度、假阴性率

灵敏度是指方法在实验条件下达到的实际最低检出水平时，检出阳性结果的阳性样品数占总阳性样品数的百分比。假阴性率是指方法在实验条件下达到的实际最低检出水平时，阳性样品中检出阴性结果的最大概率(以百分比计)。根据食药监办科〔2017〕43号《食品快速检测方法评价技术规范》中计算公式，见表5。

表5 荧光量子点免疫层析法灵敏度及假阴性率

在参比方法检测的所有阳性样本中：

参比方法的阳性样本数量(N1)=快检阳性数量(N11)+快检阴性数量(N12)

灵敏度(p+，%)=快检阳性数量(N11)/(参比方法的阳性数量(N1))×100(其中参比方法的阳性数量=快检阳性数量+快检阴性数量)。

假阴性率(pf-，%)=快检阴性数量(N12)/参比方法的阳性数量(N1)×100

本试验中，同位素稀释法高效液相-串联质谱法为参比方法，量子点荧光免疫层析为快检方法。由表6可知，在试验的193批样本中，参比方法测定的阳性样本数为53批，未检出的视为阴性样本共140批。量子点荧光免疫层析法检测的阳性样本数为52批，阴性样本数为1批，故荧光量子点免疫层析检测技术的灵敏度为98.1%，假阴性率为1.9%。

2.4 2种方法一致性的比较

同位素稀释法高效液相-串联质谱法和量子点荧光免疫层析法检测的193批玉米和小麦粉样品中，有140批样本采用2种方法均未检出呕吐毒素，其余53批样本中采用2种方法均检出呕吐毒素，2种方法测得结果见表6，其相对偏差为0.16%～4.75%。对2种方法呕吐毒素检测结果进行T检验，t=0.506 2，t双卫临尾(0.025,53)=2.311，t

表6 2种方法检测样品DON含量的比较

3 结论与讨论

量子点荧光免疫层析法检测粮食中呕吐毒素的检出限、回收率、精密度均良好，且和国标检测方法同位素稀释高效液相-串联质谱法数据对比无显著性差异，符合国标要求。因此，可以认为对荧光量子点免疫层析法快速定量检测食品中呕吐毒素的评价良好，该检测方法可以用于各地市场现场快速定量检测食品中的呕吐毒素含量，并将会在公共食品安全等领域具有重要的实际应用意义。

近年来，食品安全问题引起了全世界的普遍关注，尤其是真菌毒素超标问题。呕吐毒素在自然界中分布广泛，目前是玉米、小麦等粮食作物污染较严重并且毒性最强的天然污染物之一。量子点作为一类理想的荧光探针，不仅是传统荧光染料的补充，而且在荧光性能方面更优越，在免疫分析中的应用是一个值得引起重视的新领域。本试验利用荧光量子点免疫层析技术检测玉米及其制品中的呕吐毒素，空白玉米粉中呕吐毒素的加标回收实验取得了较好的结果，其回收率范围在85.5%～101.1%，精密度在0.4%～3.0%，与 GB 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》方法相比，该方法具有分析时间短、步骤简单、结果可靠等优点，且灵敏度、特异性均很好，可在基层快检中推广应用，同时也为该方法用于其他真菌毒素的定量荧光免疫检测提供了参考。