拜城油鸡FSHR基因多态性及其与生产性能的关联分析

丁梦琴，黑达西·巴哈提，彭凤强，胡雅丽，沙尔山别克·阿不地力大

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

促卵泡激素受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)由颗粒细胞分泌，属于G蛋白偶联受体家族成员，具有7个插入胞膜的疏水螺旋结构，存在于卵巢颗粒细胞膜上，由676个氨基酸残基组成，是促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)的特异性受体[1]。FSH是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，是一种生物大分子，不能自主透过细胞内发挥其生物学功能及作用，必须通过存在于卵巢颗粒细胞膜上的FSHR介导将FSH运送到细胞内，进而将信息传递到靶细胞膜内[2]，当激素FSH与FSHR胞外域相互作用后就启动了级联反应，直接引发促性腺激素特定的生物学效应。FSH与FSHR结合后，在活化芳香化酶的诱导下生成促黄体素(luteinizing hormone，LH)受体，可诱发排卵。因此FSHR对动物卵巢卵泡的发育、成熟和排卵具有重要作用[3]。目前，国内外对FSHR基因多态性的研究主要集中在猪、羊等哺乳动物，且FSHR基因多态性与哺乳动物产仔数密切关联[4-6]。目前，FSHR基因对家禽生产性能的影响报道较少。本研究以拜城油鸡为试验对象，采取DNA混池重测序技术筛选SNP，再通过Sequenom飞行时间质谱技术进行相关的位点分型，检测拜城油鸡FSHR基因多态性，并分析其与产蛋性能、蛋品质及孵化性能的相关性，以期为拜城油鸡生产性状的基因标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 试验在新疆乌鲁木齐市米东区长山子镇昊翔养殖专业合作社开展，随机挑选126日龄健康拜城油鸡母鸡150只，在相同饲养环境及饲粮水平下饲养。试验鸡均置于3层阶梯笼同层饲养，自由饮水，每天光照时间16 h，光照强度10 lx，采用常规的玉米-豆粕型饲粮，每天分别于08:00和19:00供料2次，其他饲养管理按种鸡场常规进行。在300日龄时采集血液，EDTA抗凝，-20 ℃保存，用于基因组DNA提取。

1.1.2 测定指标及方法 产蛋性能：每天18:00收集鸡蛋，分别记录各试验鸡开产蛋重、开产日龄、开产体重、300日龄总产蛋数、300日龄平均产蛋重，统计300日龄内每只鸡产蛋率。

蛋品质测定：在产蛋初期、产蛋中期及300日龄时分别收集每只鸡蛋并做标记，测定蛋品质。采用多功能蛋品质分析测定仪(EA-01，ORKA公司)测定蛋重、哈氏单位、蛋白高度和蛋黄颜色；采用游标卡尺测定鸡蛋纵径和横径、蛋壳钝端、中部、锐端厚度，求蛋形指数和蛋壳厚度值。

孵化率测定：在群体产蛋率达50%后，每天收集每只鸡蛋并做好标记，剔除不合格种蛋，放入蛋库，每隔5～8 d入孵一批种蛋，入孵前记录每只鸡的入孵蛋数。种蛋入孵后，根据孵化场的照蛋情况，挑出入孵种蛋中的无精蛋，跟踪记录每批入孵种蛋的死胎数和出雏数，并计算受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率及死胎率。

1.2 方法

1.2.1 血液基因组DNA提取 采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，将合格DNA置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 DNA池重测序筛选SNP 试验前期以16只拜城油鸡为试验对象，运用DNA混池重测序技术筛选到大量SNPs，为保证后续试验的可行性和准确性，将对筛选出的SNPs进行进一步的筛选。筛选条件如下[7]：①变异位点位于外显子区域；②变异类型选取错义突变；③一个基因出现多个位点变异的SNPs；④样本基因型为杂合变异；⑤测序深度>40，测序深度越深，变异位点准确性越高。最终筛选出7个SNPs位点(表1)。

表1 FSHR基因7个SNPs相关信息

1.2.3 SNP分型 将检测合格的DNA送至北京康普森生物技术有限公司采用Sequenom飞行时间质谱技术进行相关的位点分型。主要步骤如下：①引物设计：根据SNP位点序列信息，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay Design 3.1，设计PCR反应引物和单碱基扩展引物(表2)；②PCR扩增：在TaqDNA聚合酶的作用下DNA序列与引物相结合，以dNTP为反应原料、靶序列为模板对目的基因片段进行扩增；③SAP消化：将PCR混合物中所有的dNTP去磷酸化；④单碱基延伸反应：在反应体系中加入延伸引物，扩增出带有SNP位点的PCR产物，荧光标记ddNTP，通过单碱基延伸后使引物带上SNP位点碱基相关的荧光，反应产物经测序仪分析后得到SNP位点的信息；⑤质谱检测：将反应产物(共9 μL)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，进行质谱检测，并收集数据。

表2 引物信息

1.2.4 统计分析 计算7个SNPs位点的基因型频率和基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡适应性检验及遗传多样性分析。试验数据采用Excel 2010软件初步整理，使用SPSS 26.0软件的一般线性模型进行FSHR基因多态性与拜城油鸡生产性能的相关性分析。结果以平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 基因组DNA提取

提取的基因组DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测发现，条带清晰明亮，无蛋白污染(图1)。试验样品符合以下要求：D260 nm/D280 nm值在1.7～2.1之间；单个样品浓度>50 ng/μL；单个样品试验总量>2 μg；样品无大分子污染；样品保持完整，无降解，可满足后续检测要求。

M，DNA Marker；1～16，拜城油鸡样品DNAM，DNA Marker；1-16，DNA of samples in Baicheng You chickens图1 拜城油鸡基因组DNA提取Fig.1 Genome DNA extraction of Baicheng You chickens

2.2 拜城油鸡FSHR基因多态性分析

利用Mass Array技术对129个拜城油鸡样本7个SNPs进行基因分型，通过质谱软件统计分型结果发现，7个SNPs均具有多态性，且未识别出的碱基数较少，可以进行下一步SNPs位点与生产性能遗传效应的研究。利用Excel统计7个SNPs的等位基因频率和基因型频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验及遗传多样性分析，结果见表3、4。由表3可知，除SNP6外其余SNPs检出率均在90%以上，将检出率>90%的SNPs位点用于对拜城油鸡生产性能的影响分析。χ2适应性检验结果显示，除SNP2和SNP6外其余突变位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态。SNP1检测到2种基因型：CC和CA，CC为优势基因型，C为优势等位基因；SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7均检测到3种基因型，SNP2、SNP3和SNP7的基因型分别为：TT、TC和CC，优势基因型均为TC，SNP2和SNP3的优势等位基因均为T，SNP7的优势等位基因为C；SNP4的基因型分别为AA、AG和GG，AA为优势基因型，A为优势等位基因；SNP5的基因型分别为CC、CG和GG，CG为优势基因型，G为优势等位基因；SNP6检测到2种基因型：AA和GG，AA为优势基因型，A为优势等位基因。由表4可知，SNP1和SNP6均处于低度多态(PIC<0.25)，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7均处于中度多态(0.25

表3 拜城油鸡FSHR基因SNPs位点的基因型频率和基因频率

表4 拜城油鸡FSHR基因SNPs位点的遗传多样性

2.3 FSHR基因多态性对拜城油鸡产蛋性能的影响

由表5可知，SNP2位点对开产日龄具有极显著影响，CC基因型个体开产日龄极显著高于TT基因型(P<0.01)，显著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型个体开产日龄最早；SNP5位点对拜城油鸡300日龄总产蛋量具有极显著影响，对300日龄平均蛋重、开产蛋重及开产体重均具有显著影响，其中CG基因型个体300日龄总产蛋量极显著高于CC和GG基因型(P<0.01)，CG基因型个体300日龄平均蛋重、开产蛋重均显著高于GG基因型(P<0.05)，CG基因型个体开产体重显著高于CC基因型(P<0.05)；SNP7位点对拜城油鸡开产蛋重有显著影响，其中TT基因型个体开产蛋重显著高于CC和CT基因型(P<0.05)。

表5 FSHR基因SNPs对拜城油鸡产蛋性状的影响

2.4 FSHR基因多态性对拜城油鸡蛋品质的影响

由表6可知，SNP2位点对拜城油鸡蛋重具有显著影响，其中TT基因型个体蛋重显著高于CT基因型(P<0.05)；SNP3位点对拜城油鸡蛋壳厚度有显著影响，其中CC基因型个体蛋壳厚度显著低于TT基因型(P<0.05)；SNP5位点对拜城油鸡蛋壳厚度有显著影响，其中GG基因型个体蛋壳厚度显著低于CC和CG基因型(P<0.05)；SNP7位点对拜城油鸡蛋重、蛋白高度及蛋黄重均有显著影响，对哈氏单位有极显著影响，其中TT基因型个体蛋重显著高于CC和CT基因型(P<0.05)，TT基因型个体蛋白高度和蛋黄重显著高于CT基因型(P<0.05)；TT基因型个体哈氏单位极显著高于CC和CT基因型(P<0.01)。

表6 FSHR基因SNPs对拜城油鸡蛋品质的影响

2.5 FSHR基因多态性对拜城油鸡孵化性能的影响

由表7可知，SNP2对拜城油鸡入孵蛋死胚率有显著影响，其中TT基因型个体入孵蛋死胎率显著高于CC基因型(P<0.05)；其余6个SNPs不同基因型对入孵蛋孵化率、受精率和受精蛋孵化率均无显著影响(P>0.05)。

表7 FSHR基因SNPs对拜城油鸡孵化性能的影响

3 讨 论

3.1 FSHR基因多态性分析

本研究结果发现，FSHR基因在拜城油鸡外显子1、4、5、10上均存在突变位点，在挑选的7个SNPs位点中，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7位点多态信息含量均为中度多态。研究发现，在遗传多态性分析中可把有效等位基因数、遗传杂合度和多态信息含量作为衡量某群体遗传变异大小的指标，遗传多态信息指标数值越大，表明遗传变异程度越高，选择的潜力就越大[8]。本研究中，拜城油鸡试验群体多态信息含量已达到中度多态，且该群体未偏离Hardy-Weinberg平衡状态，说明在拜城油鸡群体FSHR基因上挑选出的SNPs位点多态性相对较高，遗传变异相对较大，有望获得更多的遗传进展。石宇等[9]研究发现，兔FSHR基因外显子10中存在g.163537 G>A和g.163619 A>G突变，其中g.163537 G>A为同义突变，g.163619 A>G为错义突变，编码氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸，2个位点均处于低度多态，群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态。本研究发现，FSHR基因外显子10中存在2个SNPs，均为错义突变，Hardy-Weinberg平衡检验与石宇等[9]研究结果相似。错义突变是指在基因序列中编码某一种氨基酸的密码子经碱基替换而发生改变，原本的编码功能变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使得多肽链上的氨基酸种类和序列发生本质上的变化。而氨基酸作为构成蛋白的基本结构，编码氨基酸的密码子改变后会引起编码的蛋白随之变化，基因的表达又受到蛋白的调控，从而引起生物体基因的功能发生变化。错义突变可能是一种积极的变化，自然选择有利于基因的新表达，且生物个体可能已经从该突变开发出有利的适应，在繁殖过程中将此变化传递给后代[10]。

Kang等[11]研究发现，鸡FSHR基因5′-UTR区存在1个200 bp长度的插入或缺失，以及cFSHR启动子片段检测出49个完全突变，包含39个单核苷酸替换、1个核苷酸替换和9个核苷酸的插入缺失。自先念等[12]研究发现，茶花鸡FSHR基因外显子1中发现g.34847 A>G和g.35000 C>T 2个SNPs，其中，g.34847 A>G位点只存在AA和GG 2种基因型，均属于中度多态。本研究发现，拜城油鸡FSHR基因外显子1中存在g.7640519 C>A和g.7640639 T>C 2个SNPs，其中g.7640519 C>A位点存在2种基因型，g.7640639 T>C位点存在3种基因型，多态信息含量与自先念等[12]研究结果相似。研究发现，在人FSHR基因外显子10上存在2个SNPs，2个SNPs位点均引起编码氨基酸的变化[13]；猪FSHR基因外显子10上存在3个SNPs位点，分别为：C1491T、G1885A和C1977T[14]；陇东绒山羊FSHR基因外显子10上检测到G1542T和T1595G 2个多态位点，其中T1595G 位点为错义突变，可能会引起所编码的氨基酸发生改变，此位点存在4种基因型：AA、AB、BB和AC[5]。许瑶[15]在香猪FSHR基因外显子10中发现3个SNPs位点，即rs322800083(C/T)、rs322115220(T/C)和novel 1(G/A)，其中rs322800083(C/T)位点突变引起其编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸。综上，FSHR基因在不同物种群体中均存在多态性，其中外显子1、4和10较为重要，更具有遗传选择潜力。

3.2 FSHR基因多态性与拜城油鸡生产性能的关联性

FSHR基因与动物生产繁殖性能具有紧密的关联性。研究发现，FSHR基因SNPs位点与拜城油鸡产蛋性能存在显著关联性，与Zhang等[16]研究发现北京油鸡FSHR基因存在的5个SNPs位点均与产蛋性能呈显著相关相同，其中g.-181 A>T、g.159 C>T和g.-310 A>G位点与北京油鸡不同周龄产蛋数均存在相关性，g.75470 A>G和g.75860 G>A位点对开产蛋重具有显著影响；在东乡鸡和苏肯鸡群体中FSHR基因的SNP(C1684T)对43周龄产蛋数存在显著影响[17]；但在拜城油鸡中g.7716725 G>C位点对300日龄总产蛋量呈现极显著影响，对开产蛋重具有显著影响，在不同品种鸡中FSHR基因影响产蛋量的位点不同。Li等[18]研究发现，FSHR基因多态性对信阳褐鸡的开产日龄具有显著影响；自先念等[12]研究发现，茶花鸡FSHR基因g.35000 C→T位点的TT基因型个体开产日龄显著高于CT基因型，CT基因型个体43周龄产蛋数显著高于CC和TT基因型。本试验中，FSHR基因多态性对拜城油鸡开产日龄具有极显著影响，其中g.7640639 T>C位点CC基因型个体极显著高于TT基因型，显著高于CT基因型。王克华等[19]研究发现，如皋黄鸡FSHR基因内含子2中存在3个SNPs位点，其中C+29329A位点对开产日龄、开产蛋重及40周龄蛋重均具有显著影响，C+30582G位点对40周龄总产蛋数具有显著影响；G+51411A位点对开产日龄、开产体重及40周龄总产蛋数均具有显著影响。在本研究中没有开展FSHR基因内含子处SNPs位点与拜城油鸡生产性能的关联性分析，后续可进一步探究。李亨[20]研究表明，文昌鸡FSHR基因外显子4中存在SNPs位点，且与文昌鸡300日龄产蛋数及平均联产天数呈显著相关；陈兰等[21]研究发现，京海黄鸡FSHR基因外显子1和10中均存在SNPs位点，其中外显子1突变位点对300日龄产蛋数存在显著影响，外显子10突变位点对开产日龄具有显著影响。本研究中，FSHR基因外显子1对拜城油鸡开产日龄具有极显著影响，外显子10突变位点与300日龄产蛋量、300日龄平均蛋重及开产蛋重均具有显著影响，与上述研究结果不同。综上，FSHR基因多态性与鸡各生产性能指标具有紧密的关联性，但在不同品种鸡中其SNPs位点存在差异，不同位点的基因型与不同品种鸡生产性能的关联结果也不同。

4 结 论

FSHR基因外显子1、4、5和10中的SNPs位点对拜城油鸡生产性能存在显著影响，其中外显子10中SNPs位点与拜城油鸡300日龄总产蛋量存在极显著遗传效应，与开产日龄、开产体重等产蛋性能指标及蛋重、蛋白高度、哈氏单位等蛋品质指标均存在显著关联性，外显子1中SNPs位点与拜城油鸡开产日龄存在极显著关联性。FSHR基因外显子处存在多态性，且与拜城油鸡生产性能具有显著关联性，可作为与生产性能相关的分子标记基因用于拜城油鸡高繁殖力种鸡的选育。