大尺寸石墨烯量子点组装体的制备及电化学发光性能

王瑞娜，孙瑞粉，钟添华，池毓务

（1.泉州医学高等专科学校药学院,泉州 362011；2.福州大学化学学院,福州 350108；3.自然资源部第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室,厦门 361005）

电化学发光或电致化学发光（Electrochemiluminescence or electrogenerated chemiluminescence，ECL）是化学发光分析法与电化学分析技术相结合而产生的一种新的分析方法，即通过电化学技术引发化学发光. 因无需激发光源，可有效避免光散射对于检测信号的干扰，故ECL具有灵敏度高、选择性良好和反应可控等优点［1～3］. 目前，ECL技术已被广泛应用于临床检验［4］、环境监测［5］、食品安全［6］和药品检验［7］等领域. 但ECL 尚存在发光体种类少、活性低、毒性高、标记和固定困难等问题，限制了其广泛应用.

石墨烯（Grephene）由sp2杂化碳原子密集排列成单个原子厚度的六边形蜂窝状晶格结构组成，是一种独特的二维（2D）纳米材料，因其卓越的性能和广泛的用途而备受关注［8，9］. 自2004年Geim等［10］首次通过石墨的反向剥落分离和发现单层石墨烯后，掀起了石墨烯的研究热潮，尤其是在电［11］、热［12］和机械性能［13］等方面引起越来越多的研究兴趣，然而正常状态下零带隙材料石墨烯和氧化石墨烯不能观测到发光现象［14，15］. 因此，通过各种方式操纵石墨烯带隙引起了科研人员的极大兴趣，包括通过掺杂来打开石墨烯的带隙，通过部分还原和表面钝化来操纵氧化石墨烯（GO）以及将石墨烯基材料切割成纳米级石墨烯量子点（GQDs）以诱导发光［16～18］.

量子点是一种尺寸小于激子玻尔半径的低维半导体材料［19］，作为新一代理想的发光材料在电化学发光领域表现出巨大的应用前景. 与传统的电化学发光分子相比，量子点在发光效率、光谱以及发光信号调制（如波长、电位分辨）等方面均有显著优势［20］. GQDs 为尺寸小于100 nm 的石墨烯纳米片［21］，表面带有丰富的羧基、羟基等亲水性官能团，使其具有良好的水溶性，且很容易被各种（生物）分子修饰而实现官能化［22，23］. 与其它发光体相比，GQDs具有成本低、比表面积大、毒性低、生物相容性好、化学惰性突出和光电性能独特等特点［24，25］，因而受到关注. 我国在碳点领域的研究处于国际领先地位［26］. 2012 年，Zhu 等［27］报道了在酸性条件下（3.2 mol/L HNO3和0.9 mol/L H2SO4），通过微波辅助在3 h内从石墨烯纳米片制备出黄绿色荧光石墨烯量子点（gGQDs）的方法，并率先发现该石墨烯量子点在K2S2O8体系中具有ECL 性质. 2013 年，Cui 等［28］将氧化石墨在5 mol/L HNO3中回流2 d 后再离心和洗涤，制得氧化石墨烯胶体（GO colloid），其平均高度为0.8 nm，宽度为10～60 nm，即为小尺寸石墨烯量子点，在K2S2O8共反应物存在下具有ECL性质，发射波长在512 nm. 这些研究极大地推动了石墨烯量子点在电化学发光领域的研究进展.

已报道的小尺寸的石墨烯量子点虽然具有强ECL特性，但大都因为水溶性太好，不容易固定修饰于固态电极上而只能在溶液中进行传感应用. GQDs易于在传感方面展开应用，但其本身没有ECL活性. 本研究采用硝酸刻蚀氧化石墨烯，制备了水溶性好、易修饰且具有良好ECL活性的大尺寸石墨烯量子点组装体（Large-sized graphene quantum dot assemblies，LSGQD-NAs），并探究了其ECL 性质和机理. 为基于石墨烯量子点的高灵敏ECL传感器的研究和应用提供了新的发光体材料.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

单层氧化石墨烯粉末（片径0.5～5 μm，厚度0.8～1.2 nm）购于先锋纳米材料科技有限公司（南京）；硝酸（国药集团化学试剂有限公司）；过硫酸钾（K2S2O8）［福晨（天津）化学试剂有限公司］. 其余试剂均为分析纯.

TU1950型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞公司）；FL-FS920 TCSPC稳态/瞬态荧光光谱仪（英国爱丁堡仪器公司）；激光显微拉曼光谱仪（美国Renishawin Via公司）；MPI-E型电致化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）；Isoplane光谱仪（配备ProEM HS EMCCD，美国普林斯顿仪器公司）.

1.2 大尺寸石墨烯量子点及其组装体的制备

称取30 mg 氧化石墨烯加入装有30 mL 7.5 mol/L HNO3溶液的圆底烧瓶中，在搅拌下，将烧瓶放入油浴锅中于140 ℃回流一定时间，待溶液冷却至室温后，用0.2 μm 滤膜抽滤，将滤液洗涤至中性，所得固体产物即为目标产物大尺寸石墨烯量子点及其组装体（LSGQD-NAs）. 分别经硝酸氧化回流8，16，20和24 h，所得产物分别命名为LSGQD-NAs-1，LSGQD-NAs-2，LSGQD-NAs-3和LSGQD-NAs-4.

1.3 电化学、ECL检测及ECL光谱采集

电化学和电化学发光检测：ECL检测采用三电极电化学系统，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，玻碳（GC）电极（ϕ=3 mm）为工作电极（WE）. 采用含有一定浓度K2S2O8的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4），在0～-2.5 V电位范围内进行循环伏安（CV）扫描，测定修饰有LSGQD-NAs的GC电极的电化学发光信号，将光电倍增管的高压设置为800 V. ECL光谱采集使用ECL检测系统与倒置显微镜、光谱仪和EMCCD数码相机组成的联用装置，于暗室环境下完成. 首先，将玻碳电极表面置于显微镜（4×物镜）下，调整好所需观察界面，确定摄像机拍摄范围；然后开启ECL测量系统，在电位开始扫描的同时通过EMCCD采集发光光谱.

LSGQD-NAs在GC电极上的修饰：将GC电极用0.3 μm的氧化铝抛光，用水超声清洗1 min，再用水冲洗干净，反复2次；用N2气吹干后滴加5 μL LSGQD-NAs，自然晾干，待用.

2 结果与讨论

2.1 LSGQD-NAs的制备及光学图谱表征

Fig.1 Ultraviolet(A),photoluminescent(B)and Fourier transform infrared(C)spectra of LSGQD⁃NAsa. Graphene，b. LSGQD-NAs-1，c. LSGQD-NAs-2，d. LSGQD-NAs-3，e. LSGQD-NAs-4. UV and PL spectra are recorded in aqueous solution.

产物LSGQD-NAs-1，LSGQD-NAs-2，LSGQD-NAs-3和LSGQD-NAs-4在水中的分散性良好，可以稳定存在半年以上. 由产物的紫外光谱［图1（A）］可见，当氧化石墨烯（谱线a，λmax=230 nm）被硝酸氧化为大尺寸石墨烯量子点后（谱线b～e，λmax＜210 nm）最大吸收峰位置明显紫移，且整个紫外区域的吸收程度明显减弱. 这说明随着氧化石墨烯量子点的产生和组装，其电子共轭程度比氧化石墨烯有所降低［29，30］. 由傅里叶变换红外吸收光谱［图1（C）］可知，在3500～3000 cm-1处均存在1个强且宽的吸收带，这是—COOH的O—H伸缩振动存在的明显特征，由于缔合作用，在1720 cm-1附近出现C=O的伸缩振动峰，在1370 和1050 cm-1附近出现羧基的O—H 和C—O 的面内变形振动吸收带［31］. 以上峰的出现表明氧化石墨烯和氧化石墨烯量子点表面都存在大量的羧基官能团，这些含氧官能团的存在致使其在水中具有良好的分散性. 由荧光光谱［图1（B）］可知，原始的氧化石墨烯（谱线a）和短时间（＜8 h）氧化所得的LSGQD-NAs-1（谱线b）在365 nm激发光下基本没有荧光. 随着氧化回流时间的增加，荧光开始增强（谱线c和d），这可能是因为氧化石墨烯量子点的产生增加了碳悬挂键，从而产生荧光［32］，符合石墨烯量子点缺陷态发光的机理［33］. 当氧化回流时间为20 h时，荧光强度达到最大值（谱线d），继续增加氧化回流时间，荧光反而开始降低（谱线e），由此推断在所制备的产物中LSGQD-NAs-3具有较多的的表面缺陷态，应该具有比较强的ECL特性. 基于此，研究了LSGQD-NAs的ECL性质.

2.2 LSGQD-NAs的电致化学发光行为

多种实验条件会对发光体的电致化学发光强度产生影响. 实验分别考察了制备LSGQD-NAs时的硝酸回流时间、电化学循环伏安扫描阶数、电解质溶液pH值、修饰在电极上LSGQD-NAs 的浓度及共反应物过硫酸钾的浓度等的影响.

2.2.1 硝酸回流时间和循环伏安扫描阶数对ECL的影响 分别考察了HNO3氧化回流8，16，20和24 h所得产物的ECL 行为. 由图2（A）可知，不同氧化程度的LSGQD-NAs 产物具有明显不同的ECL 行为，表明氧化回流过程中产生的石墨烯量子点表面的缺陷态具有不同程度的变化. 当回流时间从8 h延长至20 h 时，ECL 发光强度不断增强，但是LSGQD-NAs-4 的发光强度却降至几乎与LSGQD-NAs-2 的相同. 这说明氧化回流过程中产生的有利于ECL发光的石墨烯量子点表面的缺陷程度具有饱和性. 氧化回流20 h 产生的LSGQD-NAs-3 具有最强的ECL 发射强度，说明硝酸回流20 h 为产生具有最佳ECL 的LSGQD-NAs的制备条件，此结论恰好与荧光光谱表征结果相吻合.

Fig.2 Effects of oxidization time on the ECL intensity of LSGQD⁃NAs(A)and CV scanning cysles on the ECL intensity of LSGQD⁃NAs⁃3(B)（A）a. LSGQD-NAs-1；b.LSGQD-NAs-2；c. LSGQD-NAs-3；d. LSGQD-NAs-4. Inset of（B）shows the curves of current vs.potential of LSGQD-NAs-3. The supporting electrolyte was 0.05 mol/L K2S2O8 and 0.1 mol/L PBS（pH=7.0），the potential scan rate was 0.1 V/s.

通过初步实验发现，在多阶循环伏安扫描条件下，由图2（A）中谱线c连续扫描所得图2（B）中仅有第一圈有明显的氧化峰电流和强烈的电化学发光信号（红色线条），第一圈后只检测到相当于噪声的信号，且第二、第三圈的循环伏安曲线几乎完全重合［图2（B）插图中黑色曲线和绿色曲线］. 由此可知，第二、第三圈扫描时，修饰的LSGQD-NAs-3 材料稳定地附着在电极上，未发生变化，表明LSGQDNAs-3 修饰在电极上具有很好的稳定性. 结合LSGQD-NAs-3 溶液可以稳定存在半年以上，可以将LSGQD-NAs-3作为固态电极的发光材料研究.

基于以上结果，后续实验在无特殊说明的情况下所用测试样品均为LSGQD-NAs-3，ECL信号均是在第一圈循环伏安条件下测试所得.

2.2.2 电致化学发光测试条件的探究 首先考察了测试时电解质溶液酸度对LSGQD-NAs-3 产生ECL的影响. 如图3（A）所示，LSGQD-NAs-3 在酸性条件下具有最佳的ECL 行为. 由图3 中插图可知，在pH=4.0 时，LSGQD-NAs-3 在-1.6 V 附近出现了最强的氧化峰电流，随后在-2.0 V 附近发光强度达到最高. 而在pH=7.0和10.0条件下，其发光则明显减弱. 由发光曲线的突兀跳跃推断，pH=4.0的酸性条件不可能是最佳酸度条件，因此需要进一步探究. 另外，目前的ECL谱图明显不太流畅，在-1.7 V处出现明显的小峰，这可能与修饰在电极上的材料数量过多有关. 因此，实验暂不优化pH值，而是先优化显著影响LSGQD-NAs-3电致化学发光强度的修饰材料的量及共反应物的浓度.

Fig.3 Effects of solution pH(A),products concentration(B),K2S2O8 concentration(C)and specific acid solution pH(D)on the ECL intensity of LSGQD⁃NAs⁃3（A）The supporting electrolyte was 0.05 mol/L K2S2O8 and 0.1 mol/L PBS（pH=7.0）；（B）concentration of LSGQD-NAs-3（μg/mL）：a，a. 32.5，b，b. 48.75，c，c. 65，d，d. 81.25，e，e. 97.5；（C）the supporting electrolyte was 0.1 mol/L PBS（pH=4.0）；（D）the supporting electrolyte was 0.1 mol/L PBS（pH=4.0）and 0.1 mol/L K2S2O8. The concentration of LSGQD-NAs-3 was 65 μg/mL，potential scan rate was 0.1 V/s for all the experiment.

采用直径3 mm 的玻碳电极为工作电极，分别测定了修饰相同体积（5 μL），浓度分别为32.5，48.75，65，81.25 和97.5 μg/mL 的LSGQD-NAs-3 时的ECL 谱图. 由图3（B）曲线a～e可见，随着LSGQD-NAs-3 浓度的增加ECL 强度逐渐增强，当其浓度为65 μg/mL 时ECL 达到最强，继续提高浓度ECL强度开始下降［图3（B）插图］. 在曲线d和e上可以再次观察到-1.7 V处的小峰，说明当修饰材料达到一定量时会出现堆积效应，同时说明优化所用修饰材料的浓度非常必要. 后续实验均选择65 μg/mL作为研究LSGQD-NAs-3的ECL时的最佳浓度.

共反应物浓度对LSGQD-NAs 的ECL 行为也有较大影响，实验考察了K2S2O8浓度的影响. 由图3（C）可见，0.1 mol/L K2S2O8为最佳共反应物浓度条件；继续增加K2S2O8浓度，不但没有增强体系的ECL信号，反而增加了很多干扰，这可能是由于过硫酸钾本身就是ECL发光试剂所致.

在最佳修饰浓度和最佳共反应物浓度条件下，考察了体系pH值对ECL信号的影响，发现该体系的最佳酸度条件为pH=5.0［图3（D）］，此时的发光强度比pH=4.0时提高约20%. 这说明酸度条件对该体系的ECL影响很大.

2.2.3 电化学、电致化学发光图谱及ECL光谱 在最佳电化学发光条件下，测定了扫描速率为0.1 V/s时，从0 V 扫描至-2.5 V 的电流和ECL 对应电压的响应曲线. 从图4 可以看出，在电解质K2S2O8存在下，GC电极有较小的电流［图4（A）曲线a］和较弱的ECL响应［图4（B）曲线a］. 但是，当GC电极上修饰LSGQD-NAs材料后，对应电流明显增大［图4（A）曲线c］，并出现很强的ECL信号，发光位置约-2.0 V附近［图4（B）曲线c］；但在无电解质K2S2O8时，修饰LSGQD-NAs-3材料的GC电极的电流信号［图4（A）曲线b］和ECL 响应［图4（B）曲线b］均很弱. 这说明在本测试体系中，LSGQD-NAs 是发光材料，而K2S2O8是共反应物.

Fig.4 Curves of CV(A)and ECL intensity(B)vs. potentiala. Bare GCE in the presence of K2S2O8；b. LSGQD-NAs-3-modified GC electrode in the absence of K2S2O8；c. LSGQD-NAs-3-modified GCE in the presence of K2S2O8. The supporting electrolyte was 0.1 mol/L PBS（pH=5.0）and the potential scan rate was 0.1 V/s.

参考文献［34］方法，在自行搭建的电化学-光谱EMCCD采集系统上测定了LSGQD-NAs-3/K2S2O8共反应物体系的ECL光谱. 由图5可见，最大发射波长位于685 nm附近，相比于其520 nm处的最大荧光发射波长（图1）出现了明显的红移. 这说明LSGQD-NAs的光学性质与碳量子点类似，即它们的ECL波长相比于其荧光波长都出现了明显的红移，表明LSGQD-NAs表面有一定的缺陷［35，36］，表面存在部分未钝化的表面缺陷态. 另外，LSGQD-NAs的ECL发射光谱的宽发射波长范围与氧化碳纳米管相似，说明其表面缺陷态比较多样，685 nm的最大发射波长位置与氧化多壁碳纳米管几乎相同［34］，说明二者有类似的发光机理. 此结果比报道的GQDs的ECL发射波长512 nm［27］和565 nm［26］有超过100 nm的红移，说明制备的石墨烯量子点为较大尺寸，或因π-π作用组装成了较大尺寸石墨烯量子点的组装体.

Fig.5 ECL spectrum of LSGQD⁃NAs⁃3Electrolyte：0.1 mol/L K2S2O8，0.1 mol/L PBS，pH=5.0，scan rate：0.1 V/s.

Fig.6 Raman spectra of GO and LSGQD⁃NAsa. GO，b. LSGQD-NAs-2，c. LSGQD-NAs-3，d. LSGQD-NAs-4.

2.3 表面态表征

Raman 光谱是表征碳材料缺陷态的有利工具［37，38］，可通过测定LSGQD-NAs-2，LSGQD-NAs-3，LSGQD-NAs-4 和氧化石墨烯的拉曼光谱图（λex＝532 nm）来探究氧化石墨烯在硝酸氧化回流过程中形成缺陷态的过程和程度. 由图6可见，GO和LSGQD-NAs均有2个明显拉曼峰：1350 cm-1附近的D峰和1590 cm-1附近的G 峰. D 峰代表碳材料的缺陷和无序程度，G 峰代表碳材料的石墨化程度. 可以看出氧化石墨烯和石墨烯量子点都具有较大缺陷程度. 而大尺寸石墨烯量子点的拉曼光谱与氧化石墨烯（图6曲线a）相比，LSGQD-NAs拉曼光谱（曲线b～d）的G峰拉曼位移明显逐步增大，这是类石墨结构材料缺陷态存在的明显特征［39］，可能是由于石墨烯量子点及其组合体缺陷程度逐渐增加所致.

通过TEM和AFM分析进一步证实了所制备材料为大尺寸石墨烯量子点组装体. 对比氧化石墨烯的TEM 照片［图7（A）］可以看出，GO 片材表现出不规则的皱纹特征和明显的堆叠特征. 而制备的LSGQD-NAs-3的TEM照片［图7（B）］除与GO有同样的褶皱和堆叠外，片材明显减小，且石墨烯层数明显增加. 这是因为生成了大尺寸的石墨烯量子点并发生π-π相互作用，石墨烯量子点自组装成了多层石墨烯量子点组合体. AFM照片（图8）显示，氧化石墨烯片的厚度在3 nm以下，说明氧化石墨烯片大多为一层或者两三层堆叠［图8（A）］；而图8（B）中的石墨烯量子点组装体的厚度在15～25 nm之间，平均高度为20 nm，层数明显比氧化石墨烯多，表明LSGQD-NAs-3 为多层石墨烯量子点组装体，这与TEM表征结果一致.

Fig.7 TEM images of GO(A)and LSGQD⁃NAs⁃3(B)

Fig.8 AFM images of LSGQD⁃NAs⁃3

2.4 发光机理探究

纳米材料的光学性质可归因于零维量子点材料的表面态. 氧化石墨烯属于二维纳米材料，通常认为其不具备紫外-可见光区的荧光和电致化学发性质，但本研究仅将氧化石墨烯进行简单的硝酸氧化处理获得的LSGQD-NAs却具备荧光和电致化学发光性质. 综合荧光光谱、红外光谱和拉曼光谱等表征结果和ECL发光过程，推测是由于制备的大尺寸石墨烯量子点及因π-π相互作用而使石墨烯量子点自组装成多层石墨烯量点组合体的缘故而产生了发光. 因此，LSGQD-NAs-K2S2O8体系的发光机理可以归结为与碳量子点发光类似的机理［35］. 可将LSGQD-NAs 在K2S2O8存在下的发光过程用式（1）～式（4）表示，具体描述如下：LSGQD-NAs的还原产物LSGQD-NAs.-与的还原产物发生电子转移，产生激发态的LSGQD-NAs，激发态的LSGQD-NAs返回基态时产生发光（图9）.

Fig.9 Diagram of the preparation process and luminescence mechanism of LSGQD⁃NAs

3 结论

通过硝酸回流氧化石墨烯制备了具有良好水溶性和ECL活性的大尺寸石墨烯量子点组装体. 实验结果表明，大尺寸石墨烯量子点组装体表面存在大量缺陷态，在共反应物K2S2O8作用下呈现出良好的ECL特性. 详细研究了大尺寸石墨烯量子点组装体的ECL行为并推测了其反应机理. 本文报道的大尺寸石墨烯量子点具有良好的ECL活性，通过中心部位未刻蚀的氧化石墨烯进行π-π相互作用，自身组装成多层石墨烯量子点，容易在GC电极表面固化修饰，为石墨烯量子点ECL 传感器的研究提供了新方法.