嗜吡啶红球菌Rp3生长及降解粪臭素特性研究

吴玉洪，郭荣君，马桂珍，李世东

（1.江苏海洋大学环境与化学工程学院，江苏连云港 222005；2.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

粪臭素（3-甲基吲哚）是含氮杂环有机物，具有刺激性臭味[1-4]，主要为色氨酸在动物消化系统中的产物[5-7]，并随动物粪便排出体外，进而污染环境。粪臭素会损伤人体机能，引发肺相关疾病，并导致动物出现急性肺水肿等疾病[8]。近年来，利用微生物降解氮杂环类化合物已成为研究热点，乳酸菌、不动杆菌、恶臭假单胞菌、绿脓杆菌等均对氮杂环类化合物具有降解作用[9-11]。本课题组前期分离鉴定出1株粪臭素高效降解菌——嗜吡啶红球菌Rp3，该菌株在无机盐培养液中培养48 h能够将100 mg·L-1粪臭素完全降解，是非常有潜力的降解菌株[12]。因此进一步明确适宜Rp3菌株生长的碳氮源及不同因素对其降解粪臭素的影响，对该菌株的工业化生产及堆肥污染环境的修复具有重要意义。

微生物对污染物的降解作用通常受到碳氮营养、温度、金属离子等因素的影响。Kohda等[13]研究发现，PYG培养液中蛋白胨、葡萄糖、酵母粉等营养供给有利于马来提名梭菌（Clostridiummalenominatum）对粪臭素的降解；添加葡萄糖可提高芽孢杆菌（Bacillus）L1对吲哚的降解速度[14]；Fukuoka等[15]研究发现，以甘油为原料时，土壤细菌 贪铜菌（Cupriavidus）KK10在24 h内 可 将100 mg·L-1的粪臭素完全降解。温度和pH影响乳链球菌（Streptococcuslactis）6020对粪臭素的降解[16]，芽孢杆菌L1则在30℃时对吲哚降解率最高[14]。Zn2+可明显促进产碱杆菌属（Alcaligenessp.）WUST-qu菌株对喹啉的降解[17]。此外，菌株传代可能影响微生物的降解功能，如α-苯乙胺降解菌P2在多次传代后，其对α-苯乙胺的降解能力出现退化[18]。目前有关红球菌对烷烃、芳香烃、原油、有机腈、荧蒽等化合物的转化及降解研究较多[19-21]。本研究旨在探究适宜嗜吡啶红球菌Rp3菌株生长的碳氮源及不同因素对其生长和粪臭素降解效率的影响，以期对该菌株的大量培养和实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 供试菌株 嗜吡啶红球菌（Rhodococcuspyridinivorans）Rp3由中国农业科学院植物保护研究所分离获得。

1.1.2 培养基 无机盐培养基L2[12]：KH2PO40.5 g、K2HPO41.5 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO41.5 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2。LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、酵母提取物5 g，蒸馏水定容至1 L。

1.1.3 实验仪器 Flexstion3全波长扫描多功能读数仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司；LC-20A高效液相色谱仪购自日本岛津日本岛津株式会社；HCY-123B恒温振荡摇床购自太仓市豪诚实验仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粪臭素对Rp3菌株生长的影响 将Rp3菌株分别接种于含0（CK）、100 mg·L-1粪臭素的L2培养液中，28℃、180 r·min-1摇床振荡培养48 h，每处理设3次重复，测定OD600值。

1.2.2 Rp3菌株活菌数与OD600对应的标准曲线建立 将Rp3菌株接种于LB培养液中，28℃、180 r·min-1摇床振荡培养24 h。取上述培养液，5 000 r·min-1离心10 min，弃上清，用0.9%NaCl溶液重悬，再离心洗涤，该过程重复3次。将菌悬液稀释至OD600分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8，将不同OD600的菌悬液稀释涂布于LB固体培养基上，28℃培养48 h，设3次重复。以Rp3菌株菌悬液OD600为横坐标，以菌落形成单位（colony forming unit，CFU）为纵坐标，绘制细菌活菌数与OD600的标准曲线。

1.2.3 正交试验 以L2为基础培养基，根据前期预试验结果，设计蔗糖[12（A1）、14（A2）、16 g·L-1（A3）]、牛肉膏[10（B1）、12（B2）、14 g·L-1（B3）]、酵母浸粉[2（C1）、4（C2）、6 g·L-1（C3）]三因素三水平正交试验L9（34）。28℃、180 r·min-1摇床振荡培养48 h，测定OD600值，计算培养液中Rp3的活菌数，确定适宜Rp3菌株生长的碳氮源用量。判断标准：依据不同因素在水平1（K1）、水平2（K2）和水平3（K3）的实验结果总和计算各因子的k1（K1/3）、k2（K2/3）、k3（K3/3）值以及极差值Ri（同列k1、k2、k3中最大值与最小值的差）。

1.2.4 碳氮源对Rp3菌株生长和降解粪臭素的影响 以正交实验获得的适宜碳氮源为待测碳氮源，分别配制L2+适宜碳氮源（L2-N）和L2培养液，并加入粪臭素，使其终含量为100 mg·L-1。按5%的接种量加入Rp3菌悬液（OD600=0.8），以相同含量粪臭素但不接种Rp3菌液的培养液为CK，每处理设3次重复。28℃、180 r·min-1摇床振荡培养24 h，测定培养液的OD600和粪臭素含量。采用高效液相色谱法（high performance liquid chromato-graphy，HPLC）检测粪臭素的条件[12]：色谱 柱 为Hypersill BDSC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温为室温（25℃），紫外检测波长为254 nm；流动相设置甲醇∶水为90∶10（体积比），流速为1 mL·min-1，进样量10μL。计算粪臭素的降解率。

1.2.5 金属离子对Rp3菌株生长和降解粪臭素的影响 参照邓秀琼[22]的方法测定不同金属离子对粪臭素降解的影响。L2培养液中粪臭素含量为100 mg·L-1，金属离子含量：Fe2+25 mg·L-1、Mn2+50 mg·L-1、Zn2+50 mg·L-1、Mg2+100 mg·L-1，以只加粪臭素的L2培养液为对照，每处理设3次重复。28℃、180 r·min-1摇床振荡培养48 h，测定OD600和粪臭素含量，并计算粪臭素的降解率（公式1）。

1.2.6 温度对Rp3菌株生长和降解粪臭素的影响无机盐培养液L2中添加100 mg·L-1的粪臭素，分别在28、35、40℃及180 r·min-1摇床振荡培养24 h，测定OD600和粪臭素含量，计算粪臭素的降解率（公式1）。

1.2.7 传代对Rp3菌株生长和降解粪臭素的影响将Rp3初始菌株Rp3-0接种于60 mL LB培养液中，28℃、180 r·min-1摇床振荡培养，以7 d为1个传代周期，连续传代5代（Rp3-5）、10代（Rp3-10）。分别取Rp3-0、Rp3-5和Rp3-10菌悬液，于12 000 r·min-1离心2 min，弃上清，用无菌水重悬3次，调整OD600=0.8，按5%的接种量接种于L2培养液中，其中粪臭素含量为100 mg·L-1，装液量为20 mL，各处理以不接种Rp3为对照，标记为CK-0、CK-5和CK-10。28℃、180 r·min-1摇床振荡培养，每处理设3次重复。分别于24、48 h取样，测定OD600和粪臭素含量，计算粪臭素的降解率（公式1）。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 24软件对数据进行统计分析，数值采用平均值±标准差表示，采用Excel 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 Rp3菌株在粪臭素为唯一碳源培养液中的生长量

如图1所示，Rp3菌株在未添加粪臭素的L2培养液中基本不生长，在添加100 mg·L-1粪臭素的L2培养液中生长量显著高于CK（P＜0.05），表明Rp3通过降解粪臭素为其生长提供碳源。

图1 Rp3菌株在粪臭素为唯一碳源培养液中的生长量Fig.1 Growth of strain Rp3 cultured in broth with skatole as sole carbon

2.2 最适生长碳氮源正交试验结果

Rp3菌株悬液OD600与其活菌数CFU之间的标准曲线方程为y=3×109x-5×108，R2=0.971 3。对蔗糖、牛肉膏和酵母浸粉的正交试验结果表明，各组分对Rp3菌株的活菌数影响排序为酵母浸粉＞牛肉膏＞蔗糖，经计算最优组合为A3B3C3，适宜Rp3菌株生长的碳氮源及用量为蔗糖16.0 g·L-1、牛肉膏14.0 g·L-1、酵母浸粉6.0 g·L-1（表1）。

表1 培养基各组分配比优化的正交试验统计结果Table 1 Statistical results of orthogonal test for the optimization of the medium components

2.3 影响Rp3菌株生长和粪臭素降解的因素

2.3.1 适宜Rp3菌株生长及粪臭素降解的碳氮源由图2可知，Rp3菌株在L2-N培养液中的生长量显著高于L2培养液（P＜0.05）；在L2-N和L2培养液中，Rp3菌株与100 mg·L-1粪臭素共培养24 h时，对粪臭素的降解率分别为81.5%±1.19%和85.9%±2.78%，差异不显著（P＞0.05），说明在该粪臭素含量下，外源营养不影响Rp3菌株对粪臭素的降解。

图2 适宜Rp3菌株生长及粪臭素降解的碳氮源Fig.2 Carbon and nitrogen sources for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.2 适宜Rp3菌株生长及粪臭素降解的金属离子如图3所示，在含有100 mg·L-1粪臭素但去除Mg2+的L2培养液（CK）中，Rp3菌株基本不生长（OD600=0.13±0.01），显著低于Mg2+存在时的生长量（P＜0.05），说明Mg2+为Rp3菌株降解粪臭素所必需的金属离子。用Fe2+、Mn2+或Zn2+替换Mg2+时，Rp3菌株生长量显著降低（P＜0.05），其中Rp3菌株在含有Zn2+的处理中生长量最低。在含有Mg2+的处理中，粪臭素的降解率高达95.5%，替换为Fe2+、Mn2+或Zn2+时3个处理粪臭素含量差异不显著（P＞0.05），降解率均显著低于加入Mg2+的处理（P＜0.05）。上述结果说明Mg2+对Rp3菌株降解粪臭素有重要作用，Fe2+、Mn2+、Zn2+这3种金属离子虽然对粪臭素降解能力相似，但对Rp3菌株生长的影响不同，且50 mg·L-1的Zn2+明显抑制了Rp3的生长。

图3 适宜Rp3菌株生长及粪臭素降解的金属离子Fig.3 Metal ions for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.3 适宜Rp3菌株生长及粪臭素降解的温度如图4所示，随着培养温度的升高，Rp3菌株的生长量也随之逐渐升高，呈显著正相关趋势（P＜0.05）；随着温度的升高，未接种Rp3菌株的L2培养液中粪臭素含量也有所下降，说明粪臭素有一定的挥发；但接种Rp3菌株后，随着培养温度升高，各处理中粪臭素降解率逐渐提高，温度为28、35、40℃时，粪臭素的降解率分别为82.9%、93.2%和95.5%。

图4 适宜Rp3菌株生长及粪臭素降解的温度Fig.4 Optical temperature for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.4 Rp3菌株多次传代后生长及降解粪臭素能力对初始菌株Rp3-0和传代菌株Rp3-5、Rp3-10降解粪臭素能力进行测定，结果表明，培养24 h时，初始菌株Rp3-0和传代菌株Rp3-5、Rp3-10对粪臭素的降解率均在80%以上，差异不显著（P＞0.05）；培养48 h时，初始株菌Rp3-0和传代菌株Rp3-5、Rp3-10对粪臭素的降解率均达100%（表3），说明粪臭素含量为100 mg·L-1时，传代基本不影响Rp3菌株对粪臭素的降解能力。

3 讨论

粪臭素是畜牧堆肥及废水中臭气形成的主要化合物之一[23]。近年来，利用微生物降解粪臭素已成为研究热点，但不同因素对不同菌株降解效率的影响存在差异[15]。以往研究表明，外源营养物质是影响微生物降解有害物质的重要因素，外源营养物质缺乏常限制微生物生长及有机物的降解[24]。本研究中Rp3菌株不但能够以粪臭素为唯一碳源，通过降解粪臭素为其自身生长提供碳源，而且在有适宜的外源营养供应时，仍能够高效降解粪臭素，说明Rp3菌株对营养要求不苛刻，此特点非常有利于该菌株的开发和应用。除碳氮源外，金属离子也影响微生物对有机物的降解效率[25]。邓秀琼[22]研究表明，金属离子Fe2+、Mn2+和Zn2+能促进无色杆菌（Ach romobacter）DN-06对吡啶的降解；Ma等[26]研究表明，Fe2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对IDO3菌株降解粪臭素无显著影响。本研究发现Mg2+在Rp3菌株降解粪臭素过程中起着重要作用，Fe2+、Zn2+、Mn2+不能替代Mg2+，该结果与前人研究结果不一致[22,26]，分析原因可能与菌株降解酶特性有关，尚需进一步深入研究。

表2 Rp3初始菌株与传代菌株生长和降解粪臭素能力比较Table 2 Comparison of the growth and skatole degrading ability between the initial and subculture strain Rp3

培养条件在有机污染物微生物降解过程中起着重要作用，其中温度是重要的影响因子，但不同微生物降解粪臭素的适宜温度不同，如伯克霍尔德菌属（Burk h older i asp.）IDO3降解粪臭素的最佳温度为30～35℃[26]，而短乳杆菌在37℃时对粪臭素的降解效果最好[10]。本研究发现，Rp3菌株在35和40℃时对粪臭素的降解能力优于28℃。虽然温度升高时，粪臭素本身有一定挥发，但Rp3菌株处理的粪臭素含量下降更为显著。一般情况下，细菌生长会随温度的升高而升高，但Rp3菌株在不添加粪臭素的L2培养液中不生长，因此推测Rp3菌株在35～40℃时生长量增加并不是因为温度升高促进了Rp3的生长，而是因为该菌株随着温度的升高对粪臭素的降解能力提升，从而获得了更多的碳源所致。红球菌Rp3为本课题组前期从堆肥土壤中分离获得的，而堆肥温度通常高于正常环境，因此推测该菌株对高温有一定的适应性，且温度较高时，Rp3对粪臭素的降解率提高可能与该菌株本身的降解酶特性有关[12]。

微生物连续传代培养后功能退化是工业生产中常见的问题，因此传代稳定性常作为评价菌株是否具有工业化应用潜力的重要指标，不同菌株的传代稳定性因菌株特性而存在差异，如α-苯乙胺降解菌P2在多次传代后，其降解能力出现明显的退化[18]；而干酪乳杆菌在去选择压力连续传代培养后，其耐药性并未发生改变[27]。本研究中Rp3菌株连续传代10次后的降解能力并未出现退化，说明该菌株传代稳定性好，具有良好的应用潜力。

综上所述，本研究获得了利于粪臭素降解菌Rp3生长的碳氮源为蔗糖、牛肉膏和酵母浸粉，金属离子为Mg2+；明确了传代不影响Rp3菌株对粪臭素的降解，说明Rp3菌株是易培养并具有良好传代稳定性的粪臭素降解菌。研究结果为推动Rp3菌株应用于生产提供了理论依据。