一种绞股蓝根结线虫的研究初报

李 瑜，覃剑锋，刘运华，孙莹莹，唐晓东

（安康市农业科学研究院，陕西 安康 725021）

0 引言

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)属葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物，又名五叶参、七叶胆、遍地生根，是中国传统的中草药之一，具有抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、强心壮体的功效，能有效抑制血清中中性脂肪、胆固醇的生成，可以降低血脂，保护肝脏，增加食欲[1-3]。其富含硒、锌、锰等微量元素，对人体健康有明显的促进作用，在保健食品和新型药品研发上都有巨大的应用前景[4]，是一种新的药食两用植物资源[5-7]。安康是绞股蓝的最佳适生区，已形成产业化开发的格局，目前种植面积近67000 hm2，尤其是平利绞股蓝已经获得了“国家地理标志”产品保护，开发绞股蓝总甙片、绞股蓝饮品、绞股蓝食品等系列产品，经济效益十分显著，在产业精准扶贫、国家生态功能区建设方面发挥着重要作用。

根结线虫属线虫门(Nematoda)侧尾腺口纲(Secementea)垫刃目(Tylenchida)异皮科(Heteroderidea)的根结线虫属(Meloidogyne)，虫体相对较小，是一种重要的高度专化性的杂食性植物病原物，主要危害植物的地下根系，尤其是幼嫩的侧根和须根发病严重，使植物根系畸变形成大小不一的根结[8]，具有寄主广、致病性强、繁殖快和易传播扩散等特点[9]，在园艺和大田作物生产中具有很强的经济破坏力[10]。目前已报道的根结线虫有100多种，为害的植物种类有蔬菜、经济作物、药材、果树、花卉和粮食等3000多种[11-12]。但目前还未有在绞股蓝上发现根结线虫的报道。

绞股蓝的种植方式主要是传统的农田种植，由于连作障碍的影响必须2～3年轮作倒茬一次，使得用地短缺、病害频发，严重影响了安康绞股蓝的高质量发展。常见的绞股蓝病害有白粉病、叶斑病、立枯病、白绢病，虫害有三星叶甲、小地老虎、蛞蝓及小地老虎等，而绞股蓝根结线虫病却未见报道。基于此，为了解安康地区绞股蓝根结线虫的发生情况，揭示绞股蓝连作与根结线虫的关系，本研究对安康绞股蓝主产区根结线虫的发生情况进行调查，对绞股蓝根结线虫病的发病症状进行较为详细的阐述，并采用会阴花纹形态特征[13]及PCR技术[14-16]对其病原根结线虫进行分离鉴定，从而确定安康地区一种绞股蓝根结线虫病，为绞股蓝根结线虫病的防治提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

在安康发生根结线虫危害的绞股蓝主产区进行根结线虫病根采集，并用清水将采集到的根结线虫病根进行充分清洗，然后将洗净的病根放置于体视显微镜下用镊子或解剖针将根结表皮剥开观察，出现的乳白色光滑梨形物即为根结线虫的雌虫，再用解剖针将白色雌虫拨出后放入水中备用。

1.2 绞股蓝根结线虫田间调查

2021年4—5月，赴平利县长安镇中原村绞股蓝种植基地、平利县广佛镇廊坊村绞股蓝种植基地、恒口镇安康市农科院绞股蓝种植基地调查绞股蓝根结线虫危害。分别调查各调查点种植一茬、二茬、三茬及四茬以上种植的田块，每种类型随机调查10～15个地块，每田块采用“五点取样”方法共调查15株，统计绞股蓝根结线虫发病株数及发病程度，并挖取完整的绞股蓝根系带回实验室进行根结线虫的分离鉴定。

根结线虫分级采用吕军等[17]的方法。0级，根系无根结；1级，根结占全部根系的1%～25%；2级，根结占全部根系的26%～50%；3级，根结占全部根系的51%～75%；4级，根结占全部根系的76%～100%。根结线虫发生率计算见式(1)。

1.3 线虫的分离及形态学观察

参照刘维志[18]和谢辉[19]的方法将分离的绞股蓝根结线虫雌成虫制作病原根结线虫雌成虫会阴花纹，并在显微镜下观察其形态特征。

1.4 根结线虫分子生物学鉴定

1.4.1 根结线虫DNA提取 参照王曦茁等[20]与章淑玲等[21]的方法进行绞股蓝根结线虫DNA提取，并置于-20℃冰箱中备用。

1.4.2 ITS核糖体DNA序列扩增和分析 参照王曦茁等[20]的研究及方法将所分离筛选获得的绞股蓝根结线虫利用Vrain设计的线虫通用引物V5367/26S(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT/TTTCACTCGCCGT TACTAAGG)进行核糖体转录间隔区(ITS)扩增与测序。

1.4.3 系统发育树的构建 测序结果在NCBI网站进行blast比对，并从Genbank中下载相似的序列，采用NJ法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝根结线虫发病症状

通过调查发现，安康市平利县及安康市农科院绞股蓝种植基地2年生以上的植株均有根结线虫的发生，危害较轻或根结线虫侵染初期的绞股蓝植株地上部分无症状表现；受害较重时，感病植株地上部分出现植株矮小、长势弱，生长缓慢，叶片变小且黄化失绿或萎蔫，甚至有植株枯死的现象（图1a～b），发病严重的种植基地死亡率达到50%～70%。在发病绞股蓝植物根部有许多大小不一、形状不定、表面粗糙隆起的根瘤状根结（图1c），新生侧根及须根上有大量大小不等、米粒状或近圆形的根结（图1d），发病严重的根部呈现腐烂、坏死的状态（图1e～f）。将绞股蓝受害根部根结洗净后，放置在体视显微镜下切开后即能观察到白色梨形根结线虫的雌虫。

图1 绞股蓝根结线虫发病症状

2.2 绞股蓝根结线虫发病情况调查

由绞股蓝主要种植区域根结线虫危害情况调查结果（表1）可知，安康地区绞股蓝根结线虫发生危害较为普遍，在主产区平利县以及安康市农科院的种植区绞股蓝根系上均发现了明显的根结。从发病病株率及根结分级结果看，在平利县长安镇中原村相近海拔的种植基地，连作3年的绞股蓝发病率较连作2年的增加21.6%，根结分级增加1级；连作4年后较连作2年的发病率增加了52.1%，根结分级增加2级；位于安康市农科院的绞股蓝种植基地情况类似，连作3年的植株发病率比连作2年的增加21.1%，说明随着绞股蓝种植年限的延长、连作茬次的增加，感染根结线虫的发病株不断增加，危害程度也依次加重，因此推测连作种植是安康市绞股蓝根结线虫危害不断加重的直接原因之一；从绞股蓝种植区海拔高度看，不同的海拔高度对根结线虫的发生也有很大影响，位于低海拔地区的恒口镇种植区的绞股蓝发病病株率均比高海拔地区的长安镇中原村、广佛镇廊坊村的高，平均高36.53%，且发病程度也较高海拔地区严重；相同种植年限下的绞股蓝在低海拔区的发病病株率比高海拔区增加了38.2%～47.6%，发病程度均增加2级，说明海拔高度是影响绞股蓝根结线虫危害加重的重要原因，种植在适宜的海拔高度是防止绞股蓝根结线虫病加重的一个有效措施。

表1 绞股蓝根结线虫发生情况调查

2.3 绞股蓝根结线虫形态学特征

通过绞股蓝根结中的根结线虫分离及雌成虫形态特征的观察发现，分离到的根结线虫雌成虫为白色呈梨形，口针的针锥向背面弯曲，排泄孔位于口针基球处（图2a），雌成虫会阴花纹图（图2b）可见明显高而方的背弓，线纹由平滑到波浪形，有些纹线向侧面分叉，但无明显侧线。因此，初步判断绞股蓝根结线虫可能为南方根结线虫。

图2 根结线虫雌虫分离及会阴花纹观察

2.4 绞股蓝根结线虫分子生物学鉴定

利用通用引物V5367和26S将采集的绞股蓝根结线虫DNA标样2-T-1进行rDNA-ITS区域扩增，得到约760 bp的片段。通过对ITS扩增样品进行测序及BLAST比对分析，发现该NCBI序列号为2-T-1D的序列与南方根结线虫的ITS序列(KJ476151.1、KP202352.1、KP202350.1)的一致性高达99.64%。通过将标样ITS序列与在NCBI数据库下载的南方、北方、花生、爪哇、象豆、西班牙、秀丽隐杆线虫ITS序列进行聚类发育树分析发现，样品ITS序列与南方根结线虫的序列处于同一个分支，且其置信度为100%（图3）。由此确定，安康地区绞股蓝根结线虫为南方根结线虫。

图3 基于不同种群根结线虫ITS序列的聚类树

3 结论与讨论

本研究对安康绞股蓝主产区6个调查点的绞股蓝根结线虫病进行了取样调查，在安康市绞股蓝主产区均发现了不同程度的根结线虫危害，严重的地块发病率高达75.4%，给绞股蓝种植户造成了较大的经济损失。通过研究不仅初步了解了安康地区绞股蓝根结线虫危害情况、影响因素，也对绞股蓝根结线虫的发病症状进行了较为详细的描述，同时将采集分离的根结线虫病原进行形态学观察及rDNA-ITS序列分析方法分离鉴定，确定了发生在陕西省安康地区绞股蓝上的根结线虫为南方根结线虫，为进一步开展该病原线虫的研究和防控提供了参考。

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)作为根结线虫属(Meloidogynespp.)四大优势种群之一，分布广、危害大，是中国最主要的根结线虫种类，在中国的北方温带地区和南方热带地区皆有分布，目前报道的危害植物有蔬菜、水果、中药材及园林树木等[22]，但还未见有绞股蓝上发生根结线虫的文献报道。位于秦巴山区的安康自然资源优越，是绞股蓝的原产地之一，特别是平利县的绞股蓝以种类多、资源丰富、品质好在国内外享有盛誉。但在种植上，安康绞股蓝虽然有成熟的人工种植技术，却仍然存在因连作障碍导致质量下降、病害频发的问题。研究发现，根结线虫病作为一种较为严重的土传病害，其危害程度会随着重茬或连作次数的增加而加剧，本研究结果也表明绞股蓝根结线虫发病情况随种植年限的延长和连作的次数增加而依次加重。可以推测，绞股蓝根结线虫病可能是导致绞股蓝连作障碍的原因之一，因此，做好根结线虫的防治对克服绞股蓝连作障碍至关重要。

目前，根结线虫的防治主要有化学药剂防治、轮作、间作防治、生物防治和使用抗病品种等方法，其中，使用抗病品种被认为是最经济有效和无污染的方法[23]。Thies等[24]及王维华等[25]的研究表明，轮作抗根结线虫的辣椒品种在抑制南方根结线虫的生长和繁殖方面起到积极作用，可减轻黄瓜、西瓜和葫芦等葫芦科作物根结线虫病的危害。鉴于绞股蓝根结线虫病的严重危害性，在未来的生产中，对于绞股蓝根结线虫的防控更要注重高效无公害和可持续。因此，今后可从选育抗病品种、控制连作次数及轮作抗根结线虫的品种如辣椒等方面重点开展相关研究工作。

本研究对绞股蓝根结线虫病发生症状的详细阐述，对绞股蓝根结线虫病的识别与诊断有一定的参考价值，在生产实践中有重要的指导意义。同时首次确认了陕西省安康地区绞股蓝的病原根结线虫为南方根结线虫，为绞股蓝根结线虫病的进一步研究与综合防治技术体系建立提供一定的理论依据，从而保障安康绞股蓝产业的健康高效发展。