苹果组培苗移栽过程中根茎叶解剖结构变化

乔绪强，郭婷婷，杨炳松，李建召，梁美霞

（鲁东大学农学院，山东 烟台 264025）

0 引言

中国是苹果生产和销售大国，2018年中国苹果种植面积和产量均居世界首位[1]。苹果在长期的营养繁殖过程中，普遍受病毒侵染。采用苹果茎尖进行离体快繁和脱毒已获得成功[2-5]。近年来，通过基因工程进行苹果品种改良成为国内外育种专家共同关注的重要话题[6-9]。苹果茎尖离体培养可以保持高的遗传稳定性[7]，基因工程可以明显缩短苹果的育种周期，但离体培养获得的脱毒或转基因植株在移栽过程中成活率很低，这严重制约了苹果脱毒苗产业化生产和基因工程进行遗传改良的应用。在驯化移栽过程中，一品红、葡萄、咖啡、槐树和无花果等植物叶片解剖结构或表皮特征变化已有报道[10-16]，而有关组培苗根茎的相应变化未见报道。笔者以‘嘎啦’苹果组培苗为试材，研究其移栽过程中根茎叶的微观形态变化，试图从微观形态上揭示组培苗移栽过程中死亡的原因，以便为今后的组培苗移栽提供一定的理论依据和技术支持，提高苹果组培苗的移栽成活率。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

研究田间试验于2016年在鲁东大学农学院农林遗传改良中心试验田进行，室内试验在农学院农林遗传改良中心实验室内进行。

1.2 试验材料

苹果品种为‘嘎拉’。

1.3 试验方法

4月中旬—5月中旬取‘嘎拉’苹果刚萌动的新梢，剥取茎尖，用75%的酒精消毒30 s后，再用0.1%的升汞消毒3～4 min，然后用无菌水冲洗干净，接种于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂的培养基上。培养条件为每天光照16 h，光照强度2000 lx，培养温度为(26±2)℃。生根培养基为MS+NAA 0.2 mg/L。培养6周后，获得‘嘎啦’苹果的再生植株。当再生植株高达10 cm左右时，在培养室打开封口膜进行炼苗，然后取出小苗，洗去根部残存培养基，移栽到蛭石、珍珠岩和草炭土混合体积比为3:3:4的营养钵中。

驯化移栽过程中苹果组培苗根茎叶的取样时期，‘嘎啦’苹果组培苗移栽初期即0周（苹果组培苗由培养瓶中移到营养钵之时），移栽后1、2和3周。选取靠近根茎连接处并且生长粗壮的根，在根的中间部位切取0.5 cm大小的根段。位于茎中部切取0.5 cm长的茎段。从组培苗顶端向下取第4片叶片，在叶中部靠近主脉处剪取0.5 cm×0.5 cm叶块。苹果组培苗根茎叶分别取样后，用FAA固定液固定，常规制作石蜡切片。切片厚度为8 μm，番红-固绿二重染色，中性胶封片。在Nikon显微镜下观察各样品解剖结构并拍照。切取叶块后立即放入2%戊二醛中，固定24 h，乙醇梯度脱水，临界点干燥后置于观察台上金属镀膜，在KYKY-2800B扫描电镜下观察和拍照。

1.4 精密仪器和药品规格

KYKY-2800B扫描电镜，Nikon显微镜，MS培养基，NAA，6-BA，FAA固定液，2%戊二醛。

1.5 统计分析

原始数据进行标准化或归一化处理，采用Microsoft Excel 2010处理数据，用SPSS软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 苹果组培苗驯化移栽过程中根解剖结构的变化

‘嘎啦’苹果组培苗在驯化移栽过程中根的解剖结构发生明显的变化（图1）。驯化移栽初期，根的外皮层由多层较大的薄壁细胞组成，细胞排列疏松，细胞间隙大；内皮层细胞排列整齐紧密，细胞壁加厚明显。随着移栽时间的延长，外皮层的薄壁细胞变得排列紧密整齐，内皮层细胞排列整齐呈环状结构，根的维管柱不断分化发育。移栽初期（0周），根的木质部和韧皮部等组织分化不明显。1周后，根的木质部和韧皮部开始分化发育。3周后，根的输导组织木质部和韧皮部已经完全形成，在维管柱中央的木质部上清晰可见被染成红色的大量导管，导管的管孔直径较大，管壁较厚，一串相毗邻的单管孔径向地排列成链状，形成管孔链。

图1 苹果组培苗驯化移栽过程中不同时期根的解剖结构

2.2 苹果组培苗驯化移栽过程中茎解剖结构的变化

驯化移栽过程中，‘嘎啦’苹果组培苗茎的解剖结构均由表皮、皮层和中柱3个部分构成，但不同时期各部分组织内部的形态结构存在明显差异（图2）。随着驯化移栽时间的延长，皮层的厚角组织和薄壁组织分化发育逐渐完善。移栽2周后，厚角组织的细胞层数为3～4层，细胞层数明显高于移栽初期，并且细胞排列变得整齐有序。移栽初期，皮层薄壁细胞大小不等、形状不规则；1周后，皮层薄壁细胞变得大小均等，形状近圆形。随着移栽时间的延长，中柱的维管束和髓等组织也发生明显的变化。移栽初期，苹果组培苗维管束已经少量形成，若干个维管束像圆球形相拥在一起而形成的簇状结构，没有形成清晰可见的环状条带。随着移栽时间的延长，维管束逐渐形成环状条带，且条带的厚度逐渐增加，新形成的维管束不断增加，导致髓射线不断减少。移栽初期，髓细胞占整个茎半径的比例较大。移栽后，随着薄壁细胞和维管束的不断发育，导致皮层和维管束在茎半径中所占的比例逐渐增大，而髓细胞所占的比例相对下降。

图2 苹果组培苗驯化移栽过程中不同时期茎的解剖结构

2.3 苹果组培苗移栽过程中叶片解剖结构和表皮特征的变化

苹果试管苗移栽初期，苹果叶片的栅栏组织发育不完全，海绵组织细胞间隙大，栅栏组织和海绵组织细胞厚度比很低，仅为0.41。随着移栽时间的延长，叶片栅栏组织厚度逐渐增大，移栽1周后不同时期的栅栏组织厚度差异显著（表1）。栅栏组织和海绵组织分化发育不断完善，栅栏组织的细胞长度增加，细胞体积增大，细胞的层数不断增加。3周后，栅栏组织细胞层数变成2层，细胞排列变得整齐紧密，海绵组织的细胞间隙逐渐变小（图3），栅栏组织与海绵组织的厚度比逐渐变大，移栽3周后栅栏组织和海绵组织厚度比增加到0.74。

表1 苹果组培苗移栽过程中叶片解剖结构的变化

图3 苹果组培苗驯化移栽过程中不同时期叶的解剖结构

随着移栽时间的延长，苹果组培苗叶片上的气孔形态和气孔密度均发生明显变化。驯化移栽初期，气孔近圆形，突出于叶片表皮细胞之上，气孔的开度较大（图4）。随着移栽时间的延长，苹果组培苗叶片下表皮上的气孔下限程度不断增加，且气孔的开度慢慢变小。移栽3周时，苹果组培苗叶片下表皮的气孔凹陷于表皮细胞之下。移栽过程中，苹果组培苗的气孔密度不断下降。移栽3周时，苹果组培苗气孔密度下降为187个/mm2，这与移栽初期的气孔密度252个/mm2差异显著（表2）。

表2 苹果试管苗移栽过程中叶片气孔形态特征的变化

图4 苹果试管苗移栽过程中叶片表面气孔形态特征变化

3 讨论

‘嘎啦’苹果组培苗驯化移栽过程中，根茎微观形态的主要变化是输导组织木质部和韧皮部的形成和发育。木质部和韧皮部组织的充分发育是苹果组培苗适应外界环境的积极响应。其次，厚角组织是植物生长发育重要的机械组织。驯化移栽过程中，厚角组织分化发育逐渐完善。植物在缺水条件下能促使机械组织发达。驯化移栽过程中外界环境的湿度明显低于培养瓶内，这可能是导致苹果组培苗厚角组织细胞层数增加的主要原因。植物承受越多的机械压力，厚角组织细胞壁开始变厚越早，发生变化的细胞数也越多[17-18]。培养瓶内没有空气流通或空气流通较少，移栽后随着空气流通的增加，厚角组织细胞壁加厚和细胞层数明显增加，有助于移栽后苹果组培苗抗倒伏性能的提高。

叶片是植物对环境变化最为敏感的器官，叶片栅栏组织与海绵组织的分化程度可间接反映环境中的水分状态[19]。在直射阳光下发育的叶有更多的栅栏组织分化[20]。在一定环境条件下，存在着一个最佳的栅栏组织和海绵组织厚度比值，这是叶片对环境光强和叶片内光分布的适应[21]。驯化移栽初期，苹果组培苗叶片栅栏组织和海绵组织均不发达，这说明组培苗的光合自养能力较低，这主要与培养容器内光照强度相对较弱和培养基中糖含量高等有关[22-24]。移栽3周，叶片的栅海比变大，叶片栅栏组织的显著变化既可提高光合作用速率和对水分的利用率，又能保持细胞的膨压和有效维持气孔开度，防止失水造成的机械损伤，是组培苗叶片适应外界环境的表现，也是苹果组培苗由半自养半异养向完全自养转变的过程。

移栽初期，苹果组培苗叶片上的气孔突出于表皮之上，有利于水分散失，类似于水生植物的气孔形态，这种气孔结构显然有利于气体交换，又不会因为培养瓶内的高湿而引起植株失水。苹果组培苗移栽初期气孔密度较大，可能与组培条件下充足的水分、光照强度弱或培养基中的蔗糖浓度密切相关，培养基中添加蔗糖能明显增加葡萄试管苗的气孔密度[12]，2～3周时气孔密度不断变小，气孔密度的下降有利于叶片对水分的保持，同时随着移栽时间的延长，叶片下表皮上的气孔器下陷程度不断增加，气孔开口变小。气孔密度的变小和气孔下陷的形态变化均有利于组培苗叶片对水分的保持，防止水分过度蒸发，是组培苗叶片微观结构对外界环境的适应性表现[14,23]。

在驯化移栽过程中，苹果组培苗根茎叶结构的微观结构变化是其适应外界环境而进行自我调节的一种表现。根茎微观形态的变化主要是输导组织和机械组织的形成和发育，叶片栅栏组织的显著变化是组培苗光合能力提高的主要原因，气孔逐渐下陷于表皮细胞之下说明叶片的保水能力逐渐提高，能有效防止水分过度散失。根茎叶的微观形态变化是组培苗由半自养半异养向自养转变的过程。因此，前期适当的遮光保湿和选择保湿能力强的基质是提高移栽成活率的关键技术措施。