东北三省2021年水稻审定品种的核心亲本遗传多样性与籼粳分化

刘 丹，王嘉宇，冯章丽，冯 博，陈温福

(1 遵义师范学院 生物与农业科技学院, 贵州遵义 563006；2 沈阳农业大学 水稻研究所/农业农村部东北水稻生物学与遗传育种重点实验室, 沈阳 110866；3遵义师范学院 资源与环境学院, 贵州遵义 563006)

核心亲本在品种的更替过程中起重要的推动作用，它们具有使用频率高、综合性状好的特点，利用它们作为亲本容易培育出性状优良的新品种。近年来，随着种业保卫战和种子“卡脖子”问题的提出，研究核心亲本的形成和利用过程，分析核心亲本的遗传背景已成为农业领域的研究热点。目前，前人已经对马铃薯[1]、大豆[2]、甘薯[3]、油菜[4]等农作物核心亲本的演化和利用开展了相关研究，但至今为止有关东北三省粳稻核心亲本的系统研究报道相对较少。

东北三省是中国优质粳稻的主产区，水稻种植面积占中国粳稻总面积的50%以上[5]，培育出优良粳稻新品种对保障国家粮食安全意义重大。尽管相关数据统计表明[6]，近三年来，东北三省共审定水稻新品种628个，品种审定数量很大，但同质现象严重，大部分品种的推广应用率低，缺乏具有突破性的主导新品种。核心亲本的遗传多样性是影响能否育成突破性品种的关键。遗传多样性越丰富，物种对环境变化的适应能力越强[7]，用于选育新品种的潜力就越大。已有的研究表明，东北三省水稻育成品种的血缘关系比较集中，遗传基础狭隘，大部分材料具有相同的遗传背景[8-11]，但对相关的育种核心亲本的遗传多样性水平还知之甚少。因此，深入分析东北三省水稻育种核心亲本的遗传关系，有效拓宽东北三省水稻杂交亲本的遗传基础，对于育成突破性新品种已势在必行。

开展亚种间杂交，引入籼稻血缘，为拓宽粳稻遗传背景提供了新途径。Sun等[12]和高虹等[13]研究认为籼稻血缘为中国粳型超级稻增产做出了重要贡献。刘丹等[14]研究结果表明，15份东北三省育成的粳型超级稻品种均含有一定的籼型血缘。然而，目前对籼稻血缘在东北育种核心亲本基因组所占比重和利用固定区域都不明确。因此，量化东北粳稻核心亲本的血缘组成，对于充分发挥籼粳亚种间杂种优势，精准改良育种核心亲本，丰富东北稻区粳稻遗传基础具有重要的参考价值。目前，随着分子生物学的快速发展，利用分子标记从DNA水平上进行遗传基础解析已成为一种重要技术手段。为了更深入地从分子层面剖析水稻的籼粳遗传分化，研究者们根据籼粳稻亚种间的基因组序列差异，开发出了不同类型的分子标记[15-19]，其中InDel分子标记属于共显性标记，具有简单、高效、可重复性好的特点，已广泛应用于水稻的籼粳分化研究。

本研究通过对2021年东北三省审定水稻新品种的系谱进行分析，确定20份育种材料为核心亲本，并利用SSR标记和InDel标记对其遗传多样性和籼粳分化进行研究，研究结果旨在为东北地区粳稻育种的核心亲本保护、选择和利用提供重要参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验以从东北三省2021年审定的256个水稻新品种的系谱分析中筛选出的20份育种核心亲本为材料，其中辽宁省核心亲本6份，吉林省核心亲本5份，黑龙江省核心亲本9份，详细信息如表1。

1.2 水稻基因组DNA提取

在田间每份参试材料选取一个单株，于抽穗期取剑叶叶片装于自封袋，置于冰盒中带回实验室备用。取出一片叶去掉叶脉后剪碎，装于2 mL离心管，加入钢珠，利用细胞震荡破碎仪进行细胞破碎，然后采用2% CTAB法提取DNA，操作步骤参照Doyle等[20]。

1.3 分子标记选择及检测

试验选取覆盖水稻12条染色体上的78对引物进行分析，包括来源沈阳农业大学水稻研究所的44对SSR多态性引物和34对InDel籼粳特异性引物[16]，引物委托北京六合华大基因合成。PCR扩增体系为15 μL，包含DNA(20 ng/L)2 μL，前后引物各2 μL，2×Mix混合体系7.5 μL，ddH2O 1.5 μL。SSR引物PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，32个循环，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。InDel引物PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，40个循环，72 ℃ 8 min，4 ℃保存。采用6%聚丙稀酰胺变性凝胶电泳和3%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。

1.4 数据统计分析

以“0、1、9”统计SSR扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，建立相应的数据矩阵。利用PowerMarker V3.25软件[21]计算主要等位位点频率(Maf)、等位基因数(Na)、基因多样性指数(H)及多态性信息含量(PIC)，计算频率自举树，并利用MEGA7.0.21[22]软件进行NJ聚类分析。利用Structure 2.3.4软件[23-24]完成参试材料的遗传结构分析，将MCMC开始时的不作数迭代设为10 000次，将不作数迭代后的MCMC迭代设为100 000次，K值设置为1～10，每个K值都独立运算了10次。根据Structure的运算结果计算ΔK值，计算公式为ΔK= mean[|L''(K)|]/sd[L(K)]，根据ΔK值确定最可能的K值，数据处理和计算均在Excel2010上进行。

以“XX、GG、XG”统计InDel扩增带型，扩增产物带型以典型籼稻9311和典型粳稻‘日本晴’的带型为对照。同一位点上条带与9311带型一致的记为“XX”，与‘日本晴’带型一致的记为“GG”，杂合带型记为“XG”。参试材料的籼(粳)型基因频率Fx(Fg)计算公式为：

其中Mxx为纯合籼稻基因型(XX)数目；Mgg为纯合粳稻基因型(GG)数目；Mxg为籼粳稻杂合基因型(XG)数目；N为所包括引物对(位点)的数目[16]。

2 结果与分析

2.1 东北三省2021年审定水稻品种的系谱分析

根据国家水稻数据中心[6](中国水稻品种及其系谱数据库，http://www.ricedata.cn/variety/)发布的结果，东北三省2021年审定水稻品种共256个，其中辽宁省审定水稻品种16个，吉林省审定水稻品种69个，黑龙江省审定水稻品种171个。对256份审定材料的系谱进行追溯和分析，选择出20份育种核心亲本，由它们育成的品种数量172个，占育成品种数的67%(图1，A)。选择出的20份核心亲本中，辽宁省核心亲本6个，育成品种8个，水稻品种核心亲本使用占比50.00%(图1，B)；吉林省核心亲本9个，育成品种44个，水稻品种核心亲本使用占比63.77%(图1，C)；黑龙江省核心亲本14个，育成品种120个，水稻品种核心亲本使用占比70.18%(图1，D)。进一步分析发现，核心亲本‘辽星1’、‘吉粳88’、‘五优稻1号’、‘五优稻4号’、‘辽粳5’、‘龙稻5’和‘吉玉粳’这7个品种至少在两省份都得到利用。

2.2 SSR扩增多态性分析

选取的44对SSR多态性引物对20份育种核心亲本进行扩增。共检测到130个等位基因，每个引物位点扩增等位基因(Na)变幅为2～5个，平均等位基因数为2.95个(表2)。主要等位位点频率(Maf)变幅为0.30～0.95，平均主要等位位点频率为0.68。基因多样性指数(H)变幅为0.10～0.75，平均主要等位位点频率为0.41。多态性信息含量(PIC)变幅为0.09～0.70，平均主要等位位点频率为0.36。由此可见，参试材料的遗传多样性水平较低，遗传基础不够丰富。此外，引物RM259、RM246、PSM132、RM44以及RM536等位点检测到的遗传多样性参数值较大，表明这些位点能够较好地反映出参试核心亲本材料的遗传多样性。

表2 SSR多态性标记的遗传多样性信息Table 2 Genetic diversity information of polymorphic SSR markers

2.3 核心亲本遗传多样性分析

东北三省水稻育种核心亲本在44个SSR位点的遗传多样性分析(表3)显示，3个省份核心亲本的等位基因变幅为1.95～2.27，基因多样性指数变幅为0.30～0.34，多态性信息含量变幅为0.25～0.30。其中黑龙江省核心亲本的等位基因数、基因多样性指数和多态性信息含量均表现最高，表明东北三省中，黑龙江省核心育种亲本的遗传多样性最为丰富。

表3 东北三省核心亲本遗传多样性Table 3 The genetic diversity of core parents in Northeast China

2.4 核心亲本聚类分析

利用44对多态性SSR分子标记的结果，根据Nei’s遗传距离，进行NJ聚类分析。20份参试材料可分为3个类群，其中第Ⅰ类群材料包括4份材料，分别为‘吉玉粳’、‘吉粳88’、‘吉粳83’以及‘长白19’，均来自于吉林省。第Ⅱ类群材料包括10份材料，可以再细划分为2个亚类群，其中第Ⅱ-1亚群包括5份材料，来自于吉林省和黑龙江省，分别为‘长白9’、‘五优稻1号’、‘龙稻5’、‘五优稻4号’、‘龙粳10’；第Ⅱ-2亚群包括5份材料，均来自于黑龙江省，分别为‘龙粳31’、‘龙粳21’、‘垦稻10’、‘合江19’以及‘绥粳4’。第Ⅲ类群材料包括6份材料，可以再细划分为2个亚类群，其中第Ⅲ-1亚群包括5份材料，均来自于辽宁省，分别为‘铁粳7’、‘辽粳5’、‘沈农265’、‘辽粳454’、‘辽星1’；第Ⅲ-2亚群包括1份材料，为来自于辽宁省的‘盐丰47’。由此可见，‘盐丰47’与其他材料间亲缘关系较远，且东北三省20份核心亲本基本形成了各自独立的类群(图2)。进一步对这20份材料的系谱进行分析(图3)，参试20份材料的血缘均可追溯到最早期的日本水稻材料亲本，如‘丰锦’、‘爱国’、‘黎明’、‘笹锦’、‘石狩白毛’、‘早生坊主’等。‘合江19’和‘垦稻10’的血缘都有一部分来自于‘合江12’，它们具有较近的亲缘关系，这与NJ聚类图结果相符。

2.5 核心亲本遗传结构分析

基于Structure2.3.4模型，将群体数目(K)设定为1～10，10次重复，对参试材料进行群体遗传结构分析。由图4可知，当K=2时，ΔK值为652.17，此处出现最大拐点，由此可以判断出20份核心亲本可以划分为两个稳定的类群。

当K=2时，20份核心亲本的遗传结构和群体组成分析(图5)显示，20份参试材料被划分成A和B两个类群，其中A类群包含11份材料，B类群包含9份材料。进一步分析发现，参试材料中，辽宁省育种核心亲本均处于A类群，黑龙江省育种核心亲本均处于B类群，而吉林省核心亲本分布于A类群之中。

2.6 核心亲本的籼粳分化

利用34 对 InDel 标记计算参试20份材料的籼型基因频率(Fx)。由表4可知，尽管20份核心亲本遗传背景均为粳稻类型，但均含有一定的籼型血缘位点。参试材料的籼型基因频率Fx在0.01～0.19范围内，其中‘龙粳21’的Fx最大为0.19，而‘垦稻10’的Fx值最小为0.01。进一步分析东北三省不同核心亲本的籼型基因频率可知，辽宁省、吉林省、黑龙江省核心亲本籼型基因频率Fx平均分别为0.07、0.08、0.05，黑龙江省核心亲本的籼型血缘位点低于辽宁省和吉林省。

表4 20份东北水稻核心亲本的籼型基因频率Table 4 Fx of 20 rice core parents in Northeast China

3 讨 论

3.1 东北水稻核心亲本的更替

水稻品种更替对于提高产量，保证水稻生产持续增长十分必要。中国水稻育种取得了举世瞩目的成就，水稻发展先后经历了矮化育种和杂交稻育种两次技术革命，育成的水稻品种出现了多次新品种的更新换代[25]。程芳艳等[26]对黑龙江省2010～2014年审定水稻品种的骨干亲本进行追溯，发现不同积温带常以选育品种最多的亲本作为该区最新的骨干亲本，一些早期从日本引进的重要亲本如‘下北’、‘农林11’和‘屉锦’等，已经退出历史舞台，而像‘富士光’、‘上育397’和‘空育131’等日本品种，尽管建国初期在黑龙江省水稻生产和品种选育中具有重要地位，但近年来利用率不断减小，取而代之的是自主育成的品种，如由黑龙江省农业科学院五常水稻研究所选育的优质稻品种‘五优稻1号’，已成为近几年利用率较高的骨干亲本。赵一洲等[25]对辽宁省水稻骨干亲本进行分析，研究表明随着育种时间的推移，骨干亲本不断发生更替，新的骨干亲本不断产生，旧的骨干亲本不断淘汰，且亲本利用愈加向少数骨干亲本集中。本研究通过对东北三省2021年审定的256个水稻品种进行系谱分析，获得了20份育种核心亲本。对这些育种核心亲本的审定时间进行分析，发现20份材料的审定时间范围在1978～2011年，时间跨度大，核心亲本利用和更替周期较长。20份核心亲本中，2000年以来育成的品种13份，占比65%，表明2000年以来中国东北粳稻育种也取得了阶段性成就，培育出了一些新的重要核心亲本材料。同时，进一步分析还发现，20份育种核心亲本分布情况为辽宁省6个，吉林省5个，黑龙江省9个，且其中的核心亲本‘辽星1’、‘吉粳88’、‘五优稻1号’、‘五优稻4号’、‘辽粳5’、‘龙稻5’、‘吉玉粳’这7个品种至少在两省中都得到利用，表明优良的品种易被多个育种单位引用作为核心育种亲本，与前人研究结果相符。这可能是导致东北三省现有品种遗传基础狭窄，品种同质性严重的一个重要原因。此外，在核心亲本的利用过程中，一个重要问题就是如何保护和鉴别品种的真伪，更好地服务于育种。曾晓珊等[27]利用SSR标记构建了27个水稻核心亲本指纹图谱，为核心亲本的保护，品种真伪和纯度的鉴定提供了可靠依据，这也为我们下一步工作提供了思路。

3.2 东北水稻核心亲本遗传多样性

遗传多样性是进行品种资源评价的重要手段，也是水稻育种亲本选育的前提和基础。赵一洲等[28]对辽宁省水稻骨干亲本遗传多样性进行分析，发现骨干亲本间表型变化差异较小，亲缘关系较近。李修平等[29]对寒地水稻种质资源遗传多样性进行分析，认为参试寒地水稻种质遗传多样性较低。齐永文等[30]对中国水稻选育品种遗传多样性及其近50 年变化趋势进行研究，结果表明在表型、同工酶和SSR 水平上，东北稻区粳稻品种均表现出较低的多样性。本研究结果表明，参试的东北三省2021年审定水稻品种的核心亲本遗传多样性较低，亲缘关系较近，这一点与前人研究结果一致。NJ聚类和品种系谱分析表明，东北地区水稻育种核心亲本遗传基础狭窄以及这些核心亲本的高频率利用，可能是导致现有育成品种亲缘关系较近的主要原因之一。因此，要扩大现有品种的遗传多样性水平，根本在于丰富育种核心亲本的多样性水平，创新和挖掘新的优良核心种质资源。此外，本研究还发现东北三省水稻育种核心亲本中，以黑龙江省材料的遗传多样性略高于吉林和辽宁两省，这与李红宇等[8]的研究结果类似，但与王海泽[31]研究结果存在差异，分析原因可能与样本材料的类型和数量有关。

3.3 东北水稻核心亲本的籼粳分化

自20世纪50年代杨守仁在辽宁省开展籼粳杂交育种研究以来，中国东北稻区育种家利用籼粳杂交技术，在粳稻中引入籼稻血缘，拓宽东北粳稻遗传基础，培育出理想株型与优势利用相结合的超级稻品种取得了重大突破[32-36]。由于籼稻与粳稻对温度、光照的响应存在差异，明确籼稻血缘在东北水稻中的含量变化，对于东北粳稻中籼稻血缘的利用具有重要指导意义。刘丹等[14]研究表明，东北地区近年来育成的粳型超级稻品种均含有一定的籼型血缘，且随着时间的推进，近现代以来育成品种的籼型基因频率逐渐增加。刘迪等[37]研究也指出，20世纪80年代后籼粳杂交育种实践引入的籼稻基因不仅丰富了东北粳稻的遗传构成，而且“适量”籼稻血缘的应用对今后北方粳稻育种有重要作用。本研究结果表明，东北三省水稻育种核心亲本存在籼粳分化，20份参试核心亲本均为粳稻类型，但都含有籼型血缘。对东北三省不同地区核心亲本的籼型基因频率进行分析，发现三省核心亲本籼型基因频率Fx大小趋势为：吉林省>辽宁省>黑龙江省，这可能与吉林省的特殊地理位置和气候条件有关。

综上所述，核心亲本在东北水稻育种工作中发挥着极其重要的作用。今后，如何更好地拓宽水稻育种核心亲本的遗传背景，挖掘新的核心亲本资源，推进品种的更替，是摆在我们面前的一项重要工作，也是解决东北水稻种子“卡脖子”技术难题的关键所在。