柴贝止痫颗粒对颞叶癫痫大鼠海马BDNF-TrkB信号系统的影响*

刘亚粉 张 青 杨洞洞

浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

癫痫是一种以反复自发性癫痫发作（spontaneous recurrent seizures，SRS）为特征的慢性进行性神经系统疾病。目前,癫痫的治疗以抗发作药物（anti-seizure medications，ASMs）控制SRS为主，并不能从根本上治疗癫痫，且近30%的患者对ASMs治疗无效[1]，容易出现抑郁、焦虑、认知障碍、睡眠障碍和偏头痛等共患病[2]。因此，迫切需要根据癫痫的发生发展机制寻找新的治疗药物或策略。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可以通过受体-配体通路抑制癫痫的发生，这可能成为癫痫潜在的治疗靶点。柴贝止痫颗粒是临床经验用方，其对癫痫的治疗安全有效[3]，然而其抗癫痫发生发展的作用机制尚未明确。本研究模拟常见癫痫综合征颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）的发生发展过程，通过观察大鼠行为学、海马BDNF及其受体酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、下游信号分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的表达，探讨柴贝止痫颗粒对TLE的疗效及可能的作用机制，为寻找中药复方干预癫痫的新靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SD雄性大鼠50只，体质量220～250g（许可证号：SCXK（湘）2019-0004，湖南斯莱克景达实验动物有限公司）。饲养条件：室温20～26℃，相对湿度40%～70%，光照周期12小时。

1.2 实验药物：海人酸（kainic acid，KA）（Med Chem Express，cas：487-79-6）；地西泮注射液（2ml：10mg/支，上海旭东海普药业有限公司，国药准字号：H31021864）；柴贝止痫颗粒（浙江景岳堂药业有限公司制备，方中柴胡、天麻、浙贝母、法半夏、石菖蒲、牡蛎、地龙的比例为4∶5∶3∶3∶3∶10∶2，1g颗粒剂相当于原生药9.73g）。

1.3 主要实验试剂及仪器：脑立体定位仪（上海玉研科学仪器有限公司，SA-102）；微量注射泵（KD Scientific，LEGATO 130）。Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（中杉金桥，TA-08，1/2000）；Rabbit Anti BDNF（Abcam，ab108319，1/1000）；Rabbit Anti TrkB (Abcam，ab187041，1/5000）；Rabbit Anti PI3K (Abcam，ab191606，1/1000）。

1.4 造模及干预方法：分述如下。

1.4.1 动物分组：50只SD大鼠，假手术组10只，其余进行TLE造模，TLE模型大鼠随机分为模型组和治疗组。

1.4.2 建立模型：大鼠麻醉后备皮，固定于脑立体定位仪，以Bragma点作为三维坐标系的参考零点，确定SD大鼠右侧侧脑室坐标（侧脑室：x=-1.6mm，y=-0.8mm，z=-3.8mm）。标记侧脑室后，牙科钻钻孔，模型组和给药组微量注射器注射海人酸（浓度0.5μg/μl），注射3μl，注射速度为1μl/min，留针5min，缓慢退针。大鼠苏醒后观察1小时，按Racine[4]分级判定发作的级别，4～5级发作反复出现持续1小时视为造模成功，否则弃用。1小时后给予大鼠地西泮注射液（0.1mg/kg）腹腔注射终止发作。假手术组予同等方法注射同等剂量的生理盐水。

1.4.3 药物干预：造模第一天起治疗组给予柴贝止痫颗粒0.96g/kg/d灌胃（给药剂量按动物体表面积以成人用量换算，给药体积为10ml/kg·d），模型组和假手术组给予蒸馏水灌胃（10ml/kg·d）。

1.5 检测指标及方法：分述如下。

1.5.1 动物行为学观察：每组随机选取3只大鼠，于造模后11w进行视频监测1w，记录各组大鼠发作次数、每次发作持续时间，计算平均发作持续时间=每次发作持续时间之和/总发作次数。

1.5.2 标本采集：每组随机选取3只大鼠分别于造模后2d、10d取材，进行视频监测的大鼠于造模后12w取材，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，铡刀断头取出脑组织，置冰上，分离海马组织-80℃保存备用。

1.5.3 蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）：取海马组织放入研磨器中，加入液氮研磨成粉末后，加入裂解液，4℃裂解30min，在10000rpm/min离心10min，吸取上清液即得总蛋白；利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定；蛋白变性、上样、电泳1～2h，湿法转膜30～50min；相应一抗、二抗孵育后，ECL曝光；用“Quantityone”软件分析BDNF、TrkB、PI3K、GAPDH蛋白条带灰度值。

1.6 统计学方法：使用SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料符合正态分布用（±s）表示，方差齐采用单因素方差分析，两两比较选用LSD法。设置双侧检验水准α=0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物行为学评价：各组大鼠总发作次数、平均发作持续时间比较：见表1。

表1 各组大鼠总发作次数、平均发作持续时间比较（±s）

表1 各组大鼠总发作次数、平均发作持续时间比较（±s）

注：与模型组比较，#P＜0.05。

组别模型组治疗组平均发作持续时间（秒）43.00±4.58 33.33±3.79#总发作次数（次）46.00±7.00 32.00±4.36#

2.2 不同时间点各组大鼠海马BDNF、TrkB和PI3K表达比较：见表2、图1。

表2 各组大鼠海马BDNF、TrkB和PI3K表达比较（±s，目标蛋白/GAPDH OD值）

表2 各组大鼠海马BDNF、TrkB和PI3K表达比较（±s，目标蛋白/GAPDH OD值）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

2d 10d 12w组别假手术组模型组治疗组PI3K 0.62±0.06 0.68±0.06 0.71±0.07 BDNF 1.36±0.14 1.02±0.10*1.02±0.10*TrkB 1.54±0.15 1.32±0.13 0.89±0.09#PI3K 0.96±0.10 1.08±0.11 0.94±0.09 BDNF 1.00±0.10 0.99±0.10 1.16±0.12 TrkB 1.58±0.16 1.63±0.16 1.68±0.17 PI3K 1.14±0.11 1.36±0.14 1.43±0.14 BDNF 0.96±0.09 0.75±0.07*1.28±0.12*#TrkB 0.94±0.09 0.92±0.09 1.03±0.10

图1 WB检测各组大鼠海马BDNF、TrkB和PI3K的表达

3 讨论

TLE属于中医学痫病范畴，病位主要涉及肝、脑，病理因素以郁、风、痰为主。其反复发作、经久难愈可能与气郁久滞、顽痰难化有关[5]。因此，柴胡剂广泛用于痫病的治疗[6,7]。柴贝止痫颗粒是在《伤寒论》柴胡加龙骨牡蛎汤和《医学心悟》定痫丸的基础上加减化裁而成，制成颗粒剂更方便临床应用。方中柴胡为君，苦辛而微寒，疏肝解郁、条达肝气，使肝风易止、痰郁得散；天麻性味甘平，熄风止痉、平肝潜阳，浙贝母苦寒，化痰清热散结，半夏辛温，燥湿化痰，共为臣药；牡蛎、地龙咸寒，熄风定惊、软坚散结，共为佐药；石菖蒲引药入脑络，并制他药之寒凉，兼为佐使。诸药合用，共奏疏肝理气、化痰熄风、醒神开窍之功。本研究发现，柴贝止痫颗粒可减少TLE大鼠发作次数、降低平均发作持续时间，提示该颗粒剂对TLE具有一定的治疗效果。

BDNF是神经营养因子家族的重要成员之一，TrkB是BDNF的高亲和力受体，PI3K是BDNF-TrkB下游的信号通路之一。许多细胞和动物研究表明，BDNF水平降低与癫痫发病率增加有关[8]，BDNF-TrkB信号的缺失可导致SRS[9]，BDNF可通过降低GABA能神经元兴奋性[10]、减轻癫痫发生相关的炎症反应[11]抑制癫痫。临床研究也证实BDNF水平的降低与癫痫的发生之间存在直接关系[12]。本研究中模型组大鼠海马BDNF在TLE急性期（造模后2d）、慢性期（造模后12w）均降低，验证了BDNF在TLE发生发展中的作用。然而TrkB、PI3K未表现出与TLE的相关性，提示BDNF可能通过其他靶点参与TLE的发生发展。经柴贝止痫颗粒治疗12w后，可提高BDNF的表达，这可能是该颗粒剂干预癫痫的机制之一。柴贝止痫颗粒可以作为一种新型的癫痫治疗措施应用于临床，但该颗粒剂通过提高BDNF抑制癫痫发生的确切分子机制有待进一步研究。