水产养殖环境中典型抗生素的分配和降解行为研究

李贞金

(上海市环境科学研究院 国家环境保护新型污染物环境健康影响评价重点实验室，上海 200233)

0 引 言

中国是世界上最大的水产养殖国家，年养殖产量达到世界总年产量的70%左右[1]。水产养殖过程中广泛使用抗生素治疗和预防水产品的细菌性感染，投加的抗生素仅有20%～30%被水产品吸收，大部分以原药的形式排入环境[2-3]。养殖塘与地表水体交换较少，更易赋存抗生素，成为抗生素的蓄积池[4-6]。

抗生素进入环境后会发生水解、光解、生物降解和吸附作用等一系列反应，共同促成抗生素在养殖环境中的积累和衰减。相同抗生素在不同水基质中的反应可能会有很大差异，Choo等[7]研究发现相同环境条件下，土霉素在海水中的降解半衰期是淡水中的5倍。此外，在各类抗生素之间的反应也有所不同[8-9]。因此，以实际养殖环境为背景基质研究目标抗生素的特异性反应才能了解养殖塘中抗生素的实际归趋。

本研究基于先前的研究结果[10]，选取水产养殖中常用且在养殖水体中检出率较高4种抗生素(磺胺甲基嘧啶、恩诺沙星、金霉素和甲氧苄啶)作为研究对象，通过在实验室模拟控制多种影响因素，研究了4种抗生素在养殖水体中的水解、光解、生物降解和综合因素下的降解特征,并分析了在3种水-沉积物系统(鱼塘、虾塘和蟹塘)中的迁移与分布规律，旨在为深入了解水-沉积物系统中抗生素归趋提供数据支持，为水产养殖业抗生素赋存风险防控提供科学依据。

1 试验材料和方法

1.1 供试水样和沉积物

供试水样和沉积物采自上海市青浦区某水产养殖区，选取抗生素背景值低的鱼塘、虾塘和蟹塘进行采样。水和沉积物的理化性质如表1和表2所示。

表1 水产养殖区水的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of water in the aquaculture area

表2 水产养殖区沉积物的理化性质Table 2 Physical and chemical properties of sediments in the aquaculture area

1.2 主要仪器与材料

低温真空冷冻干燥器(LDG-0.3C，上海昊博有限公司)、全自动氮吹仪(AUTO-EVA，厦门睿科仪器股份有限公司)、全自动固相萃取仪(Fotector Plus，厦门睿科仪器股份有限公司)、微波萃取仪(CEM MARS CLASSIC，美国CEM公司)、高压灭菌锅(YXQ-LS-50G，上海精胜科学仪器设备有限公司)、恒温培养箱(SPX-150，上海坤天仪器设备有限公司)、高效液相色谱串联质谱仪(Waters Acquity HPLC@Hclass - Waters Xevo TQ-S micro，美国Waters公司)。

磺胺甲基嘧啶(SM1，纯度99.72%)、甲氧苄啶(TMP，纯度99.1%)、恩诺沙星(ENR，纯度99.9%)、盐酸金霉素(CTC，纯度94.6%)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，色谱级甲醇、乙腈和甲酸购自德国Merck公司。

标准溶液的配制准确称取10.00 mg抗生素标准品，用甲醇溶解配制成100 mg·L-1的抗生素标准液，-20 ℃避光冷藏保存。

1.3 检测方法

用高效液相色谱串联质谱仪分析目标抗生素。色谱柱为BEH-C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；色谱柱柱温35 ℃；进样量1.5 μL；流动相流速0.35 mL·min-1；流动相A是体积浓度为0.5%的甲酸-水溶液；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～2.2 min，16% B；2.2～2.5 min，16% B～95% B；2.5～5.5 min，95% B；5.5～6.0 min，95% B～16% B；6.0～10.0 min，16% B。

质谱采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式(MRM)进行检测；碰撞气为高纯氩气；脱溶剂气温度为500 ℃，脱溶剂气流速度为1 000 L·Hr-1，锥孔电压为30 V，毛细管电压为3.5 kV，扫描时间为0.1 s。4种抗生素的质谱分析参数见表3。

表3 4种抗生素的质谱检测条件Table 3 Detection conditions of mass spectrometry analysis for 4 antibiotics

1.4 实验方法

1.4.1 水环境中抗生素的降解

供试水样：本实验选用鱼塘水作为背景溶液，经0.7 μm滤膜过滤，防止水中颗粒物对实验结果产生影响。4种抗生素在背景溶液中均未检出。

(1)水解实验

准确量取200 mL水样于250 mL玻璃瓶中，高压灭菌锅121 °C灭菌40 min，然后置于恒温培养箱培养1 d，相同方式再灭菌2次。实验设置2个浓度，均匀地将4种抗生素的混合溶液加入至水样中，使初始抗生素浓度分别为50 μg·L-1和200 μg·L-1，玻璃瓶用铝箔纸包裹，瓶口用封口膜密封后拧紧瓶盖，放置于25 ℃的恒温培养箱中。分别在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取样，取样量为1 mL，经0.22 μm 水相(聚醚砜)针式过滤器至棕色进样瓶中，立即测定。

(2)光解实验

准确量取200 mL水样于250 mL玻璃瓶中，在高压灭菌锅内121 °C灭菌40 min，然后置于恒温培养箱培养1 d，相同方式再灭菌2次。实验设置2个浓度，均匀地将4种抗生素的混合溶液加入至水样中，使初始抗生素浓度分别为50 μg·L-1和200 μg·L-1，瓶口用封口膜密封后拧紧瓶盖，放置于25 ℃的恒温培养箱中，设置光照强度为3 000 lux。分别在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取样，取样量为1 mL，经0.22 μm水相过滤器至棕色进样瓶中，立即测定。对照组置于黑暗条件下，其他实验程序均相同。

(3)生物降解实验

准确量取200 mL水样于250 mL玻璃瓶中，均匀地将4种抗生素的混合溶液加入至水样中，使初始抗生素浓度分别为50 μg·L-1和200 μg·L-1，玻璃瓶用铝箔纸包裹，瓶口用透气封口膜密封后放置于25 ℃的恒温培养箱中。分别在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取样，取样量为1 mL，经0.22 μm 水相过滤器至棕色进样瓶中，立即测定。对照组实验与水解实验程序相同。

(4)水体中的综合降解实验

准确量取200 mL水样于250 mL玻璃瓶中。实验设置2个浓度，均匀地将4种抗生素的混合溶液加入至水样中，使初始抗生素浓度分别为50 μg·L-1和200 μg·L-1，瓶口用透气封口膜密封后放置于25 ℃的恒温培养箱中，设置光照强度为3 000 Lux。分别在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取样，取样量为1 mL，经0.22 μm水相过滤器至棕色进样瓶中，立即测定。

1.4.2 水-沉积物系统内抗生素的降解

模拟实验容器采用20 cm×20 cm×20 cm的玻璃缸。沉积物与水的比例为1∶4(v∶v)，即3.5 cm沉积物层和14 cm水层(5.6 L)。实验前先将沉积物均质化，除去石块、植物杂质等。静置平衡3 d后，将2.8 mL 100 mg·L-1的4种抗生素标准混合溶液滴加至水相中，使水相中抗生素的初始浓度为50 μg·L-1，过程中缓慢搅拌水相使抗生素分布均匀并保证沉积物层不受干扰。玻璃缸放置在阳光充足且通风良好的实验室里，实验室温度设置为25 ℃，水相分别在0、8 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、56 d取样，取样量为1 mL，经0.22 μm水相针式滤器至棕色进样瓶中，立即测定。沉积物物相分别在0、3、7、14、21、28、42、56、80、90 d取2 g表层沉积物，经前处理过程后进样检测，前处理方法参考李贞金等[10]的方法。

上述实验均设置3组平行。

1.5 数据分析

数据为3组平行实验的算术平均值，实验结果由OriginPro 9.0 进行拟合和作图。

降解实验的数据采用一级反应动力学方程进行拟合，公式如式(1)所示：

Ct=C0e-kt

(1)

式(1)中：C0是抗生素的初始浓度，μg·L-1(或μg·kg-1)；Ct是t时间时抗生素的浓度，μg·L-1(或μg·kg-1)；e是自然底数；t是时间，d；k是一级降解速率常数。

半衰期(DT50)可以通过如式(2)计算：

DT50=ln2/k

(2)

沉积物对抗生素的吸附能力可以用吸附系数(Kd)表示：

(3)

式(3)中：Cs是沉积物中抗生素的平衡浓度,μg·L-1；Caq是水中抗生素的平衡浓度,μg·kg-1。

2 结果与分析

2.1 水环境中抗生素的降解

(1)水解

图1 4种抗生素在养殖塘水中的水解过程Fig.1 Hydrolysis process of 4 antibiotics in the aquaculture water

一级反应动力学方程可以较好地拟合水解反应，初始浓度为50 μg·L-1时，SM1、ENR和CTC的水解半衰期分别为152.6、115.9、59.2 d。

(2)光解

经过56 d光解实验后，SM1、ENR和CTC都表现出了明显的光解现象(图2)。初始浓度为50 μg·L-1的CTC在21 d时就已经完全降解、SM1在56 d时完全降解、ENR光解率为63.6%、TMP几乎不发生光解。从图2中可以看出，SM1、ENR和CTC的光解规律相同，都是初始降解速率较快，随着时间的延长降解速率逐渐降低。

图2 4种抗生素在养殖塘水中的光解过程Fig.2 Photolysis process of 4 antibiotics in the aquaculture water

一级反应动力学方程能较好地拟合光解反应，初始浓度为50 μg·L-1时，SM1、ENR和CTC的光解半衰期分别为17.4、33.0、3.5 d。对比不同文献中报道的光解速率或降解半衰期可以发现，与本研究结果有较大差异。胡学香等[11]研究发现，模拟太阳光照下，四环素类抗生素的半衰期范围在26～136 min之间，低于本实验结果。Knapp等[12]的研究结果显示，在全日照和半日照条件下，ENR的降解半衰期分别为0.8 d和3.7 d，低于本实验结果。闻长虹等[13]指出在不同条件下，磺胺甲恶唑的光解半衰期最小为2.1 h，低于本实验结果。综上所述，本实验光解半衰期较其他研究结果偏高，这可能是不同的光照强度、水的基质组成和不同的初始浓度设置等原因引起的。

(3)生物降解

经过56 d的培养，初始浓度为50 μg·L-1时SM1、ENR、CTC和TMP的生物降解率依次为60.0%、10.7%、100.0%和15.8%。初始浓度为200 μg·L-1时，4种抗生素的生物降解率依次为47.7%、31.1%、100.0%和7.7%。提高初始浓度后，SM1和TMP的生物降解受到抑制，而ENR的生物降解率明显提高(图3)。

图3 4种抗生素在养殖塘水中的生物降解过程Fig.3 Biodegradation process of 4 antibiotics in the aquaculture water

4种抗生素的生物降解规律相似，均表现为初期和后期的降解受到抑制。Yang等[14]的研究显示，磺胺类在最初的12 h内生物降解被抑制，由于易于生物降解的物质优先被利用。这与本研究的结果一致，4种抗生素在前三天基本没有生物降解。Yuan等[15]研究表明，有些抗生素的降解产物会保留抗生素本身的毒性，甚至表现出更大毒性，这可能是后期SM1、ENR和CTC降解速率下降的原因。

4种抗生素的生物降解反应均可以用一级反应动力学方程能较好地拟合，SM1、ENR、CTC和TMP的生物降解半衰期分别为31.3、328.5、5.3、259.6 d。Lin等[16]报道了虾塘水中磺胺类的降解半衰期大于300 d，高于本实验结果。Xu等[17]的研究显示磺胺甲恶唑在水中生物降解半衰期为14.2～16.9 d，低于本实验结果。抗生素的生物降解行为取决于许多因素，如温度、pH、含氧量、微生物的群落组成和物质的可利用性等[18]。

(4)水体中的综合降解

实际水环境中抗生素的衰减是水解、光解和生物降解等因素共同作用的结果，它的衰减速率可能不仅仅是各个反应速率的代数和。本实验通过模拟抗生素在鱼塘水中的实际降解过程，同时考虑多个反应同时发生时抗生素的浓度变化，探究它们的降解行为。

2种浓度下(50 μg·L-1和200 μg·L-1)4种抗生素的综合降解情况如图4所示。

图4 4种抗生素在养殖塘水中的综合降解过程Fig.4 Comprehensive degradation process of 4 antibiotics in the aquaculture water

经过56 d的降解，初始浓度为50 μg·L-1时SM1、ENR、CTC和TMP的降解率分别为100%(42 d)、94.7%、100%(7 d)和18.1%。比较4种抗生素的降解速率，CTC在养殖塘水体中最易降解，其次是SM1和ENR，TMP在水环境中的持久性最强。

4种抗生素的降解过程均可以使用一级反应动力学方程拟合，得到一级降解速率常数和半衰期(DT50)如表4所示。SM1、ENR、CTC和TMP在初始浓度为50 μg·L-1时的综合降解速率常数为0.070 1、0.043 8、0.431 07、0.003 14 d-1，降解半衰期为9.8、15.8、1.6、220.7 d。4种抗生素的综合降解速率比任何一个单一反应的降解速率都要快。

表4 4种抗生素在养殖塘水中的综合降解一级反应动力学常数及半衰期Table 4 The first-order reaction kinetic constants and half-lives of the comprehensive degradation of 4 antibiotics in the aquaculture water

2.2 水-沉积物系统内的降解

抗生素进入养殖水体后，会通过吸附迁移至沉积物中。通过引入沉积物因素，模拟水产养殖塘的水-沉积物系统，探究了SM1、ENR、CTC和TMP在3种不同的水-沉积物系统中的迁移、分布和衰减规律，可以反映实际养殖塘中抗生素的命运。

(1)水中抗生素的衰减

初始浓度为50 μg·L-1的SM1、ENR、CTC和TMP在3种模拟养殖塘水体中的衰减行为如图5所示。经过56 d的降解，4种抗生素均在0～7 d内快速衰减，SM1、ENR、CTC和TMP在实验前7 d的衰减量分别为30.4%～35.3%、83.6%～92.0%、94.2%～96.7%和48.3%～56.7%，明显高于单独在水环境中前7 d的衰减量，特别是TMP(水环境中几乎不降解)。通常，抗生素扩散到沉积物层是十分迅速的，它们在水相中的衰减主要是沉积物的吸附和化学转化(尤其是光解)之间的竞争过程，因此，在自然环境中很难区分吸附和降解[19]。

不同的养殖塘中ENR和CTC的衰减行为相似，0～7 d迅速衰减，之后衰减速率变缓(曲线斜率变小)，而SM1和TMP的衰减行为差异较大，不同养殖塘中2种抗生素的差异分别发生在21 d后和7 d后，推测可能与生物降解有关，不同水体中微生物群落组成不同，导致同一物质的降解性能出现差异。

拟合一级反应动力学方程得到4种抗生素的一级降解速率常数和半衰期(DT50)，如表5所示。比较4种抗生素在水相中的半衰期：SM1>TMP>ENR>CTC，ENR、CTC和TMP的半衰期低于仅在水环境中的半衰期，而SM1的半衰期高于仅在水环境中的半衰期。由于本实验运行于光照强度较弱的冬季，加上水中悬浮颗粒物对光的屏蔽作用，可能使室内模拟实验的光解速率大大降低。

表5 4种抗生素在不同品种养殖塘水中的一级反应动力学常数及半衰期Table 5 The first-order reaction kinetic constants and half-lives of 4 antibiotics in the water of different ponds

(2)沉积物中抗生素的吸附

以沉积物中抗生素的最高浓度作为平衡浓度，计算4种抗生素的吸附系数(Kd)如表6所示。SM1、ENR、CTC和TMP的Kd值范围分别为1.52～3.14、26.65～40.44、4.79～12.06、1.16～3.86 L·kg-1，抗生素与沉积物的亲和力排序如下：ENR>CTC>SM1和TMP，这与实际环境中抗生素的拟分配系数排序相似，SM1和TMP主要吸附机制为疏水分配，ENR和CTC的主要吸附机制为离子交换和离子架桥，后者的作用力更强，因此更易吸附在沉积物中[20-21]。4种抗生素的分配系数均低于实际环境计算结果的2～4个数量级，由于模拟实验计算的是刚处于平衡状态时抗生素的分配系数，而实际水环境中抗生素经过一定时间的光解和生物降解，并且沉积物可长期对抗生素进行积累，从而导致其更高的分配系数。

不同养殖塘中抗生素的吸附系数也有明显不同，除TMP外，3种抗生素在鱼塘中的吸附系数最高，其次是虾塘，蟹塘最低。这可能是因为不同的沉积物具有不同的理化性质，Hari等[22]发现诺氟沙星在土壤和污泥上的吸附系数是淡水沉积物的40～600倍。有机物含量和阳离子交换量是影响抗生素吸附的最主要因素[23]。Sassmann等[24]通过实验证明了四环素的吸附主要取决于沉积物中阳离子交换量，阳离子交换量越高，Kd值越大。然而，本实验中抗生素的吸附系数并没有表现出与这两因素明显的相关性，说明沉积物基质复杂，抗生素的吸附受各种因素共同作用的影响[25]。

(3)沉积物中抗生素的降解

沉积物中4种抗生素在90 d里的浓度变化如图6所示。沉积物中4种抗生素的浓度均表现出先迅速增加(吸附作用)，后降低至平稳的趋势(主要是生物降解)。有研究表明，沉积物的光解只发生在沉积物表面1 mm深度，因此沉积物中抗生素的衰减仅考虑生物降解因素。

取峰值至实验结束期间的数据，拟合一级反应动力学方程得到4种抗生素的一级降解速率常数和半衰期，如表6所示。SM1、ENR、CTC和TMP在沉积物中降解半衰期的范围分别为8.2～20.5、6.1～75.5、29.1～60.5、26.7～42.5 d。不同种类抗生素在沉积物中的半衰期存在差异，CTC和TMP在3种养殖塘中均表现了出较高的持久性，SM1的平均半衰期较低，ENR的半衰期在不同的沉积物中差异较大。Yang等[26]研究得到土壤中磺胺类的半衰期为12～18 d，与本实验的研究结果相近，说明SM1的生物利用度高。Liu等[27]研究显示，在有氧和无氧的土壤中TMP的半衰期分别为4 d和11 d，低于本实验结果。Pan等[28]研究表明四环素在有氧和无氧的土壤中降解半衰期为57.8 d和86.6 d，Gottschal等[29]在农田土壤中观察到氟喹诺酮类抗生素的半衰期超过了217 d。CTC和ENR的降解半衰期长且生物降解率随着时间增加而降低，可能由于抗生素通过二次吸附反应迁移至微孔和纳米孔中，这些孔对于微生物和酶来说太小，使其暂时不被生物降解或形成了生物不可利用的螯合物，从而延长了它们在沉积物中的残留时间[30]。因此，四环素类和氟喹诺酮类抗生素在沉积物中的残留应引起人们的重视。ENR在鱼塘中的降解半衰期(6.1 d)明显低于虾塘(75.5 d)和蟹塘(58.1 d)，这可能是存在其他反应促进了ENR的衰减。据报道沉积物中普遍存在的氧化铁能够氧化氟喹诺酮类抗生素，因此氧化物丰富的沉积物有利于ENR的衰减。水和沉积物中抗生素的半衰期差异明显，沉积物中抗生素的持久性普遍高于水相，这是由于水和沉积物中抗生素的反应类型和分配过程不同引起的。

表6 4种抗生素在不同品种养殖塘沉积物中的一级反应动力学常数、半衰期和分配系数Table 6 First-order reaction kinetic constants,half-life and partition coefficient of 4 antibiotics in the sediments of different ponds

图6 4种抗生素在不同品种养殖塘沉积物中浓度变化情况Fig.6 Concentration changes of 4 antibiotics in the sediments of different ponds

3 结 论

养殖水体中，水解对目标抗生素的降解贡献率很小，光解和生物降解为SM1、ENR和CTC在养殖水体中的主要降解途径，TMP几乎不降解；4种抗生素的综合降解速率比任何一个单一反应的降解速率都要快。3种不同养殖类型的水—沉积物系统中，水相4种抗生素均在0～7 d内快速衰减，明显高于单独在水环境中的衰减量，特别是TMP，主要受到吸附作用的影响；平衡时，4种抗生素的吸附系数排序为ENR>CTC>SM1和TMP，不同养殖塘中抗生素的吸附系数存在明显差异；沉积物中抗生素的持久性普遍高于水相，CTC和TMP在3种养殖塘中均表现出较高的持久性，ENR在不同沉积物中的半衰期差异很大，沉积物的理化性质可能对抗生素的降解产生显著影响。养殖塘中沉积物是抗生素的主要归宿，抗生素的长期赋存可能诱导抗性基因的产生，应当引起人们的重视。