理肠饮治疗腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证的临床疗效及机制研究

尹德菲,魏秀楠,刘佳卉,程艳,刘彤,迟莉丽

(1.山东中医药大学附属医院,山东 济南 250014;2.山东中医药大学中医学院,山东 济南 250014;3. 山东中医药大学第一临床医学院,山东 济南 250014)

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一种常见的功能性肠病,其全球发病率高达11.2%[1],其中,以腹泻型肠易激综合征(IBS-D)亚型最为常见,约占IBS的74.1%[2]。IBS-D的发病机制尚未完全阐明,目前认为是多种因素共同作用引起的脑-肠互动异常[3]。脑-肠轴是大脑和胃肠道之间进行双向调节的复杂神经体液通信网络,脑肠肽在脑和肠呈双重分布,是脑-肠轴运转的关键物质,其分泌或表达异常可致内脏高敏和胃肠动力紊乱[4-5],而内脏高敏感和胃肠动力异常是IBS的病理生理基础[6-7]。随着微生物组学的发展与应用,肠道菌群在IBS-D发病中发挥重要作用也逐渐被证实[8-9],肠道菌群作为人体的“第二大脑”,与脑-肠互动关系密切,可通过神经、内分泌、免疫和信号传导等途径参与构成菌-脑-肠轴,肠道微生态失衡如菌群结构失调、代谢产物活性改变、小肠细菌过度生长(Small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)均可诱导IBS-D的发生发展[4,10-12],肠道菌群与脑-肠互动之间的交互调控异常可能是IBS-D发病的关键机制。目前西医针对IBS的治疗方法主要是对症治疗,尚无特效药,中医治疗本病显示了其独特优势,已成为研究热点,但存在具体疗效机制、作用靶点尚不明确等问题[13]。

山东省名中医药专家迟莉丽教授及其团队根据本病的主要临床表现及证候演变规律,认为肝郁脾虚是IBS-D的基本病机,运用自拟方理肠饮治疗,临床疗效显著。前期临床及基础研究显示该方可降低IBS-D患者内脏高敏感、调节结肠动力、改善焦虑抑郁状态,且具有调控IBS-D模型大鼠脑肠肽的作用[14-18]。为进一步探索及阐释理肠饮治疗IBS-D的深层机制,本研究基于菌-脑-肠轴理论,进一步观察理肠饮治疗IBS-D肝郁脾虚证患者的临床疗效及其对血清脑肠肽[血清P物质(Substance P,SP)、5-羟色胺(Serotonin,5-HT)]及肠道菌群的影响,分析理肠饮的效应机制及作用靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料

收集2020年9月至2021年10月山东中医药大学附属医院脾胃病科门诊及住院的IBS-D肝郁脾虚证患者66例。基于课题组前期研究表明理肠饮治疗IBS-D效果显著[14-18],本研究采用2∶1反应适应性随机化方法[19],目的在于将受试者以较大概率分配到疗效更好的组别,保证受试者利益最大化。其中,中药组44例(脱落2例,失访1例);西药组共22例(脱落2例)。2组患者基线资料比较无统计学差异(P>0.05),具有可比性,见表1。本研究已通过山东中医药大学附属医院伦理委员会审批[审批号:(2020)伦审第(030)号-KY]。

表1 2组患者基线资料比较Table 1 Comparison of general data of the two groups of patients

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照罗马Ⅳ[20]IBS-D的诊断标准。反复发作的腹痛,近3个月内平均发作至少每周1次,至少伴有以下2项:①与排便相关;②伴有排便频率的改变;③伴有粪便性状(外观)的改变,>1/4的排便为Bristol粪便性状6或7型,且<1/4的排便为Bristol粪便性状1或2型。以上症状出现至少6个月,且近3个月符合以上标准方可诊断。

1.2.2 中医诊断及辨证标准 中医泄泻的诊断标准参考《中药新药临床研究指导原则》[21]:大便次数增多,每日3次以上,便质稀溏或水样便。

中医辨证标准参照《中国肠易激综合征中医诊疗专家共识意见(2017年)》[22]中肝郁脾虚证标准。主症:①腹痛即泻,泻后痛减;②急躁易怒。次症:①两胁胀满;②纳呆;③身倦乏力。舌脉:舌淡胖,可有齿痕,苔薄白;脉弦细。符合主症2项及次症2项,结合舌脉,即可辨证。

1.3 纳入标准

①年龄18～75岁,男女不限;②符合以上中西医诊断标准及辨证标准;③近1周排便日记报告Bristol粪便性状6型或7型≥4 d且Bristol粪便性状1型或2型<4 d;近1周平均每日腹痛评分≥3分;④治疗前2周内未服用抗生素、益生菌制剂、抗抑郁药物及对肠易激综合征症状有治疗作用的药物;⑤签署知情同意书,自愿受试。

1.4 排除标准

①糖尿病、甲状腺功能异常者;②严重的急/慢性器质性疾病及肾病或肝病者;③既往腹部手术史者;④孕期或哺乳期妇女;⑤有酒精、药物滥用史者;⑥智力或行为障碍不能给予充分知情同意者。

1.5 脱落及终止标准

未完成本方案所规定的疗程(≤80%)及观察周期,作为脱落病例;治疗过程中发生严重不良事件或者发生严重不良反应及并发症,或自行加用对肠易激综合征症状有治疗作用的药物者,予终止试验。

2 方法

2.1 治疗方法

西药组给予口服双歧杆菌三联活菌胶囊(培菲康,上海信谊药厂有限公司,生产批号:0420200936,药品规格:210 mg·粒-1),每日2次,每次630 mg,早、晚餐后0.5 h服用,匹维溴铵片(得舒特,法国Abbott Products SAS公司,生产批号:712407,药品规格:50 mg·片-1),每日3次,每次50 mg,餐中吞服。

中药组予理肠饮水煎剂口服,药物组成:炒白术30 g,党参15 g,茯苓15 g,白芍15 g,柴胡12 g,香附15 g,高良姜6 g,桂枝9 g,陈皮9 g,防风9 g,炙甘草6 g。中药饮片由山东中医药大学附属医院中药房提供,每日1剂,水煎400 mL,分早、晚餐后0.5 h温服。

2组均连续治疗4周。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 临床疗效观察 于治疗前、治疗2周、治疗4周采用IBS症状严重程度量表(IBS-SSS)从腹痛程度、腹痛频率、腹胀程度、排便满意度及生活困扰度5个方面评分。采用IBS-SSS等级疗效评定法[23]评估2组患者临床疗效,痊愈:IBS-SSS总积分<75分;显效:总积分好转2个级别;有效:总积分好转1个级别;无效:总积分无改善或变差。愈显率=(痊愈例数+显效例数)/总例数×100%;总有效率=(痊愈例数+显效例数+有效例数)/总例数×100%。

2.2.2 中医证候积分评估 于治疗前后参照《中药新药临床研究指导原则》[21]中泄泻肝郁脾虚证评分标准进行评分,总积分为主症和次症各积分相加,见表2。

表2 中医泄泻肝郁脾虚证积分评分标准Table 2 Evaluation standard of TCM syndrome score

2.2.3 血清脑肠肽指标检测 随机选取2组各10例患者,于治疗前后早晨空腹抽取静脉血5 mL,3 500 r·min-1离心10 min取血清,置于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA法检测患者血清SP及5-HT水平变化,试剂盒购自上海将来实业股份有限公司,货号分别为JL11060、JL10725，检测仪器为Rayto RT-6100酶标分析仪。

2.2.4 粪便菌群检测 治疗前后取上述2组20例患者粪便样本,置于2 mL无菌冻存管中,于-80 ℃冰箱内保存,使用NovaSeq PE250测序平台，采用16S rDNA测序技术进行比较分析,由北京诺禾致源生物科技有限公司完成检测。

2.2.5 安全性评价 治疗前后检测2组患者血、尿、粪常规,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及尿素氮(BUN),记录药物不良反应。

2.3 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行统计分析。计数资料以频数描述,采用2检验;计量资料以表示,符合正态分布的采用t检验,不符合正态分布的计量资料及有序等级资料采用秩和检验。多个观察时点的总积分数据资料,若符合正态分布、方差齐,则采用重复测量资料方差分析;不符合正态分布的采用秩和检验。所有统计推断为双侧检验,检验水准以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 2组患者治疗前后IBS-SSS积分情况比较

结果见表3～4。

表3 2组患者治疗前后IBS-SSS积分比较Table 3 Comparison of IBS-SSS scores between 2 groups before and after treatment

表4 2组患者IBS-SSS积分临床疗效比较Table 4 Comparison of clinical efficacy between 2 groups of patients

3.2 2组患者治疗前后中医证候积分情况比较

结果见表5。

表5 2组患者治疗前后中医证候积分情况比较[M(P25,P75)]Table 5 Comparison of TCM syndrome scores between 2 groups before and after treatment [M(P25,P75)]

3.3 2组患者治疗前后血清脑肠肽检测结果比较

结果见表6。

表6 2组患者治疗前后血清SP、5-HT含量比较Table 6 Comparison of serum SP and 5-HT levels in2 groups before and after treatment

3.4 2组患者治疗前后肠道菌群16S rDNA测序分析

3.4.1 样本测序量及深度 40份样本经16S rDNA测序后,共获得2 736 201条高质量序列,平均68 405条序列/样本(序列范围56 081～81 580条),共生成3 629个ASV。物种稀释曲线随着测序深度的增加曲线逐渐平坦,提示测序深度足够。物种累计箱形图曲线随着样品量的增加而逐渐平坦,提示样品量足够,见图1。

图1 物种累计箱型图Fig.1 Cumulative box plot of species

3.4.2 肠道菌群多样性分析 α多样性分析可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性。结果显示,治疗后,2组反映物种丰富度的指数Chao1指数、Observed_otus指数均明显下降(P<0.05,P<0.01)。西药组反映肠道菌群物种多样性的Shannon指数较治疗前下降(P<0.05),中药组Shannon指数无明显变化(P>0.05),见图2A。

β多样性分析可以反映不同样本微生物群落构成的差异。通过主坐标分析(PCoA)对样品进行聚类,结果显示2组患者治疗前和治疗后被明显区分开,经Permutational MANOVA检验证明2组患者治疗前组间比较无统计学意义(P>0.05),治疗后,2组微生物群落构成均发生明显改变(P<0.05),且组间比较具有显著差异(P<0.01),见图2B。

注:BL.中药组治疗前;AL.中药组治疗后;BP.西药组治疗前;AP.西药组治疗后;与本组治疗前相比,*P<0.05,**P<0.01。图2 2组患者治疗前后肠道菌群多样性比较Fig.2 Comparison of the diversity of intestinal flora in 2 groups before and after treatment

3.4.3 LEfSe物种差异分析 为进一步分析肠道菌群特异性物种,本研究对中药组和西药组治疗前后多级物种进行线性判别分析(LEfSe),LDA值分布柱状图中展示了LDA score>设定值(默认设置为4)的物种,即组间具有显著差异的Biomarker。柱状图的长度代表差异物种的影响大小(即为LDA score)。在进化分支图中,由内至外辐射的圆圈代表了由门至属(或种)的分类级别。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类,小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。通过LEfSe对2组患者治疗后的Biomarker进行了初步筛选,发现Clostridium_sensu_stricto_1、Megamonas、Bacteroides_plebeius、Veillonella_magna等菌属/种为中药组治疗后优势菌群(P<0.05),见图3A～B。Ruminococcus_gnavus_group菌属为西药组治疗后优势菌群(P<0.05),见图3C～D。

图3 肠道菌群LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis of intestinal flora

3.4.4 功能预测 差异菌群在GO数据库比对到的基因有6 906个,利用单因素方差分析对不同组功能丰度进行统计。在二级水平上基于功能丰度的组间差异分析表明,中药组治疗前后有统计学差异的功能蛋白有440项(P<0.05),其中有极显著差异的功能蛋白有103项(P<0.01)。中药组治疗后显著下调的蛋白主要有LacI家族转录调节因子(LacI-TFs)、多糖转运系统通透酶蛋白、转酮醇酶(TK)、响应调节因子YesN等。西药组治疗前后有统计学差异的功能蛋白有43项(P<0.05),其中有极显著差异的有10项(P<0.01),西药组治疗后显著下调的蛋白主要有苏氨酸醛缩酶(TAs)、辅助基因调节子B(Agr B)、趋化蛋白CheY、鞭毛钩相关蛋白2(HAP2)、趋化偶联蛋白CheW等。

本研究通过Picrust2对代表性序列进行功能预测,挖掘其潜在作用靶点及代谢通路,在KEGG数据库比对得到的通路有400个。在二级水平上基于功能丰度的差异分析表明,与治疗前比较,中药组治疗后有统计学差异的通路有57项(P<0.05),其中有显著差异的有7项(P<0.01),芳香族氨基酸生物合成的超通路、N10-甲酰四氢叶酸生物合成明显减少,见图4A。与治疗前比较,西药组治疗后有统计学差异的通路有8项(P<0.05),甲基赤藓糖醇磷酸盐途径Ⅰ/Ⅱ(MEPⅠ/Ⅱ)、香叶酰二磷酸生物合成Ⅱ、异丙醇生物合成等明显减少,见图4B。

图4 KEGG Pathway差异分析Fig.4 KEGG Pathway difference analysis

3.5 安全性评价

2组患者均未出现与药物相关的不良反应,治疗前后三大常规、ALT、BUN无明显差异,表明2种治疗方法均具有安全性。

4 讨论

理肠饮是迟莉丽教授治疗IBS-D的经验方,由痛泻要方合柴芍六君子汤加减化裁而来,方中炒白术补脾燥湿以培土,为君药;党参健脾益气、茯苓健脾利湿,二者与炒白术配伍,培土扶脾,白芍柔肝缓急、柴胡辛开苦降,二者一散一收、疏达肝气,与健脾药相配,土中泻木,共奏柔肝补脾之功,共为臣药;香附疏肝理气,高良姜、桂枝温阳化气、散寒化饮,陈皮理气和胃、醒脾化湿,使全方补而不滞,防风气味辛散,舒达肝脾,引药入脾经,共为佐使;炙甘草补益脾气为使药。诸药合用,共奏疏肝解郁安神,健脾化湿止泻、解痉止痛安肠之效,以期达到心身同治、脑肠同调之功。本研究结果显示,治疗后,中药组IBS-SSS积分、中医证候积分均显著改善,且临床整体疗效及中医证候总积分均优于西药组。既往研究表明,IBS与功能性消化不良、胃食管反流病等多种消化系统功能性疾病存在症状群的重叠,且彼此之间可以互相转换,增加了临床诊断与治疗的难度。中医证候单项积分改善情况,显示出理肠饮可全面改善IBS-D患者的多重症状。

脑肠肽如SP、5-HT的分泌和表达异常可致内脏高敏和胃肠动力紊乱[4-5]。SP是最早发现的具有神经递质和激素双重作用的脑肠肽,可通过脑-肠轴促进肥大细胞脱颗粒并释放组胺,增加痛觉传递,导致内脏高敏,同时能促进肠蠕动,增加结肠动力[24-26]。5-HT是肠道痛觉传导的重要调节物质,其表达增加,可使内脏过敏感,导致腹痛[27]。有研究表明,5-HT异常表达可能是IBS-D肝郁脾虚证的物质基础。本研究发现理肠饮可不同程度降低血清5-HT、SP含量。结合疗效评价结果及课题组前期研究,表明理肠饮可通过下调SP、5-HT水平改善内脏高敏、调节肠动力,从而减轻腹痛腹泻等症状。

此外,本研究分析了IBS-D患者治疗前后肠道菌群多样性及菌群结构的差异。综合α及β多样性分析结果表明经过治疗,2组患者肠道菌群丰度下降,整体菌群结构发生了显著变化。本研究中的差异菌属Ruminococcus_gnavus_group、Clostridium_sensu_stricto_1均为产丁酸菌属,丁酸为短链脂肪酸(SCFAs)之一,是肠上皮细胞的主要营养物质,对IBS-D患者存在的肠道低度炎症具有修复作用[28-29],同时,SCFAs可以和次级胆汁酸协同调节5-HT肠道水平[30]。进一步对肠道菌群进行功能预测结果发现,中药组治疗后具有显著差异的功能蛋白及通路主要与糖代谢有关。既往研究表明可发酵的寡糖、二糖、单糖和多元醇(FODMAPs)容易被肠道菌群发酵产生气体,增加液体负荷和内脏高敏感[31],而引起5-HT等脑肠肽的代谢紊乱,并上传至中枢系统,从而加重IBS的症状[32]。理肠饮可能通过降低糖类合成、降解,降低内脏敏感性,调节脑肠肽从而缓解IBS-D症状。此外,氨基酸类神经递质在IBS-D发病中有调节作用,肠道菌群对宿主蛋白质过度分解产生各种生物活性化合物,如色氨酸作为5-HT代谢产物的前体,其代谢中断和氧化应激增加都会影响脑肠肽的产生和释放,诱导IBS-D的发生发展,并且导致焦虑或抑郁的发生[33-35]。中药组治疗后芳香族氨基酸通路丰度明显降低,提示理肠饮可能通过作用于肠道菌群改善氨基酸的代谢,调节脑肠肽,以发挥治疗作用。由此可见,肠道菌群在菌-脑-肠轴的运转中发挥着重要的媒介作用,可能是理肠饮发挥作用的关键靶点[36-38]。

综上所述,理肠饮治疗IBS-D肝郁脾虚证可有效减轻患者临床症状、改善生活质量,安全有效。其机制可能是通过纠正肠道菌群紊乱,增加有益菌、减少致病菌,协调糖酵解与代谢相关菌群的功能,通过菌-脑-肠轴调控血清SP及5-HT水平,从而缓解内脏高敏及动力紊乱,达到治愈IBS-D的作用。由于微生物系统庞大、IBS-D发病机制复杂,诸多肠道菌群、脑肠肽与相关调节蛋白及代谢通路的关系仍不明确,其生物学机制还有待进一步研究。后续研究中,本课题组将脑肠肽与肠道菌群的相关性进行分析,继续挖掘二者深层关系;并纳入健康志愿者,增加样本量,进一步筛选IBS-D发病与治疗相关的靶菌做更深入研究,以期找到IBS-D新的治疗靶点和特异性的生物学标志物。