山西老陈醋酿造过程四甲基吡嗪形成规律及稳定性研究

王家东，刘丹彤，王馨宇，冯智伟，谢三款，郑宇，何静

1(信阳农林学院 制药工程学院，河南 信阳，464000)2(天津科技大学 生物工程学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津，300457)3(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京，100015) 4(中粮油脂研发中心，天津，300452)

食醋是世界范围内应用最为广泛的酸性调味品，中国的传统食醋主要以谷物为原料，由多种微生物混合发酵而成[1-2]。发酵过程多种微生物共同作用代谢产生丰富的醇、酸、酯、醛、酮、酚和吡嗪等挥发性香气成分[3-4]，以及不挥发酸、氨基酸等不挥发性风味物质，共同赋予食醋特殊的风味和口感[5-6]。不同的微生物在各个发酵阶段的作用不尽相同，由曲霉、根霉等霉菌以及部分芽孢杆菌产生的淀粉酶完成了淀粉质原料的糖化和液化，再由酵母菌进行酒精发酵，最后由醋酸菌、乳酸菌等微生物完成醋酸发酵，在整个发酵体系中有上千种微生物存在[7-9]。

吡嗪类化合物不仅是食品中具有熏香的风味物质，还具有多种功能活性，其有利于健康和疾病治疗的作用机制已经得到较深入的研究，主要包括三甲基吡嗪和四甲基吡嗪等[10]。四甲基吡嗪广泛存在于各种发酵类食品中，如食醋[11]、可可[12]、白酒[13]、奶酪[14]等，也是食醋中最重要的风味物质之一，山西老陈醋国家推荐标准GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》中将其定为重要的特征指标之一。目前已知的四甲基吡嗪的合成途径的主要前体化合物是乙偶姻，发酵过程微生物代谢产生乙偶姻，接着乙偶姻与环境中的NH4+或NH3通过非酶促反应生成中间产物氨基丁酮，再与乙偶姻缩合生成四甲基吡嗪[15-16]。乙偶姻不仅是四甲基吡嗪的重要前体，其本身也是一种具有奶香的重要风味物质，其浓度对食醋的风味也有重要影响[17-18]。LU等[19]采用宏基因组学的方法对食醋菌群在乙偶姻/双乙酰代谢途径中的分布进行了分析，揭示了镇江香醋中产乙偶姻的功能微生物组成及其代谢网络。在醋酸发酵阶段，乙偶姻的生物合成需要alsS和alsD基因分别编码α-乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase，ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(acetolactate decarboxylase，ALDC)[20-21]。多种细菌通过该途径合成乙偶姻，如植物乳杆菌、发酵乳杆菌、枯草芽孢杆菌等[22]。铵是四甲基吡嗪合成的另一重要前体，同时，铵还是微生物的重要氮源以及微生物利用其他氮源进入合成代谢途径的关键中间体[19,23]。XIAO等[24]对食醋中的乙偶姻和铵进行检测，发现铵和乙偶姻均与四甲基吡嗪相关性显著，四甲基吡嗪的含量对两者具有高度依赖性。XIE等[25]通过宏转录组学分析，构建了食醋固态发酵中铵的代谢网络，结果表明，在山西老陈醋发酵过程微生物通过增强氨基酸代谢从而增加细胞内铵的生成，以响应外界环境酸度的增加。除此之外，四甲基吡嗪还可以通过美拉德反应和Strecker降解化学法合成，即α-氨基酸与还原糖形成Amadori重排产物，随后发生重排形成α-二羰基化合物等还原酮，经Strecker降解为α-氨基化合物，最后缩合成形成吡嗪类化合物[26-27]。然而，在对传统食醋四甲基吡嗪形成规律研究中，大多只关注了乙偶姻形成途径，而忽略了氨基酸等化合物对四甲基吡嗪形成的影响，以及四甲基吡嗪自身的降解等[19,23]，对食醋发酵过程四甲基吡嗪的形成规律认识仍不全面。本研究分别从四甲基吡嗪的生成和降解2个方面对传统食醋四甲基吡嗪形成规律进行分析，进一步分析比较了熏醅温度对四甲基吡嗪以及其他风味物质积累的影响，加深了对传统食醋四甲基吡嗪形成机制的认识，有利于山西老陈醋产品品质的提升和质量控制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

山西老陈醋酿造全过程酒醪、醋醅等样品均取自山西省太原市某山西老陈醋生产企业。

1.1.2 实验试剂

NaCl、KH2PO4、K2HPO4、牛肉提取物、酵母提取物、乙酸、盐酸，天津市北方天医化学试剂厂；无水葡萄糖，天津市元力化工有限公司；蛋白胨，天津市天大化学试剂厂；酵母膏、吐温-80，天津市化学试剂三厂；以上试剂均为分析纯。四甲基吡嗪标准品，色谱纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent 6890N-5973型气-质联用仪，美国Agilent仪器有限公司；S-433D氨基酸自动分析仪，德国SYKAM公司；CP1502电子分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司；ZWF-110X系列温控往复水浴恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山西老陈醋发酵过程四甲基吡嗪及主要前体化合物变化规律分析

取适量酒醪于50 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃去沉淀，溶液保留备用。称取醋醅或熏醅5 g于50 mL离心管中，加入45 mL去离子水，室温振荡3 h后，8 000 r/min离心5 min弃去残渣，浸提液保留备用。分别分析样品中四甲基吡嗪在整个发酵过程中的变化规律。

固态醋酸发酵阶段是山西老陈醋四甲基吡嗪形成的主要阶段，因此重点分析了食醋固态发酵过程乙偶姻、双乙酰、氨基酸等主要前体化合物的变化规律。利用SIMCA 13.0软件对数据进行主成分分析。

1.2.2 温度和酸度对四甲基吡嗪稳定性的影响

将300 g成熟醋醅装入500 mL三角瓶中，检测30、40、70、80、95、100 ℃条件下四甲基吡嗪及其主要前体化合物乙偶姻的浓度变化，分析温度对四甲基吡嗪生成的影响。

配制200 mg/L的四甲基吡嗪标准品水溶液，分析其在30、40、70、80、95、100 ℃条件下的浓度变化。在95 ℃加热8 h后向三羟甲基丙烷(trimethylolpropane，TMP)水溶液中添加盐酸、乙酸和等体积的去离子水，观察相同加热条件下不同酸环境对溶液中TMP含量的影响。

1.2.3 熏醅温度对山西老陈醋风味轮廓的影响

将300 g成熟醋醅装入500 mL三角瓶中，利用铝箔纸密封，设定恒温箱温度分别为85、95、105 ℃，熏醅时间为3 d，每天翻动醋醅进行混匀，测定各实验组熏醅前后醋醅主要理化指标、四甲基吡嗪以及挥发性风味物质组成及其浓度变化，确定最佳熏醅温度。

由挥发性物质根据文献检索的信息，将同一香气属性的挥发性物质的相对香气活性值相加，即为山西老陈醋该香气属性的得分，将各个香气属性的得分绘制成雷达图，即为山西老陈醋的香气轮[28]。

1.2.4 分析方法

四甲基吡嗪、乙偶姻和双乙酰的定量分析采用HPLC法。样品经0.45 μm过滤后直接进样；色谱柱Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)；流动相为5 mmol/L H2SO4溶液；流动相流速0.6 mL/min；柱温65 ℃；检测器为示差检测器。

挥发性风味物质分析采用顶空固相微萃取-气相色-质谱联用(head space-solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)方法测定。取2 g样品置于20 mL气相玻璃瓶，加6 mL去离子水，2 g NaCl加入磁力搅拌器转子，密封，插入固相微萃取头，60 ℃水浴吸附40 min，磁力搅拌速度为100 r/min。将萃取头放置在进样口(250 ℃)解吸5 min，运行仪器。GC-MS检测升温程序：35 ℃维持1 min；1 ℃/min升温至70 ℃，维持2 min；5 ℃/min升温至230 ℃，维持2 min；15 ℃/min升温至280 ℃，维持1 min。隔垫吹扫流量3 mL/min，模式为不分流，He载气流速1 mL/min，色谱柱Agilent HP-5(30 m×250 μm×0.25 μm，Agilent，USA)。Agilent 6890 N系列气相色谱仪和5973质谱仪。MS扫描范围为30～600。检测器温度220 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，捕获方式为全扫描(从40～500m/z)。将得到的每个样品的质谱数据与NIST library对照相匹配，对匹配度>80(最大为100)的鉴定结果予以确认，结合保留时间、质谱图谱、保留指数和相关文献对其挥发性成分定性，利用图谱库工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行定量分析，求得各样品中挥发性风味物质成分的相对含量。

浸提液中还原糖含量测定采用菲林法，总酯含量采用皂化返滴定法测定，铵的定量测定采用水杨酸法；氨基酸的定性定量采用氨基酸自动分析仪检测[25, 28]。

2 结果与分析

2.1 山西老陈醋发酵过程四甲基吡嗪及其前体化合物变化规律分析

山西老陈醋以高粱为主要原料进行发酵生成，主要包括酒精发酵、醋酸发酵和熏醅3个阶段，过程中四甲基吡嗪变化趋势如图1所示。

图1 山西老陈醋酿造全过程四甲基吡嗪变化趋势Fig.1 Changes in tetramethylpyrazine during the whole brewing process of Shanxi aged vinegar

酒精发酵阶段检测到少量四甲基吡嗪，含量在10-2g/kg高粱以下，随后在醋酸发酵阶段含量少量增加，在醋酸发酵末期达到(0.159±0.008) g/kg高粱。熏醅阶段是四甲基吡嗪积累的主要阶段，呈现先增加后降低的变化趋势。熏醅第3天四甲基吡嗪的含量达到最大值，为(2.692±0.110) g/kg高粱，与熏醅之前相比提高了15.93倍。此外，在熏醅阶段，还产生了少量三甲基吡嗪和二甲基吡嗪等吡嗪类化合物，其分别占吡嗪类化合物总相对含量的10%和2%。该研究结果与前期报道的山西老陈醋[29]、镇江香醋[30]等的研究结果一致。在镇江香醋醋酸发酵阶段吡嗪类化合物总量随着发酵的进行逐渐增加，其中四甲基吡嗪含量最多占杂环类总量的82%[31]。虽然食醋样品中吡嗪类化合物的浓度较低，但由于其较低的阈值，其对食醋风味的贡献仍然较大[11]。

醋酸发酵阶段四甲基吡嗪开始生成，与微生物代谢密切相关，因此重点分析了醋酸发酵阶段四甲基吡嗪主要前体化合物的生成情况(图2)。

a-乙偶姻、双乙酰、铵态氮；b、c-氨基酸；d-主成分分析图2 山西老陈醋醋酸发酵过程中四甲基吡嗪主要前体化合物的变化Fig.2 Changes of main precursors of tetramethylpyrazine during acetic acid fermentation in Shanxi aged vinegar

如图2-a所示，乙偶姻含量在醋酸发酵过程中呈现逐渐增加的变化趋势，在发酵结束时达到最大值(52.10±3.20) g/kg高粱，占整个发酵过程的94.17%。双乙酰含量则呈现逐渐下降的趋势，在醋酸发酵结束其含量为(4.74±0.06) g/kg高粱。因此，乙偶姻是主要的非含氮前体(91.66%)，在微生物代谢过程中主要由丙酮酸经α-乙酰乳酸转化而来。含氮前体中包含铵和氨基酸，铵在醋酸发酵过程中呈现逐渐增加的变化趋势，在发酵结束时含量达到最大值(0.81±0.02) g/kg高粱(以铵态氮计)。山西老陈醋醋酸发酵过程中氨基酸含量变化如图2-b、图2-c所示，大部分氨基酸的含量在醋酸发酵过程中呈现上升的趋势，如谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和酪氨酸；含量呈现下降变化趋势的氨基酸有苏氨酸、酪氨酸和脯氨酸；苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、组氨酸和丝氨酸变化趋势不明显。其中，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量较高。

对醋酸发酵过程中四甲基吡嗪与其主要前体化合物的主成分分析，如图2-d所示，第1主成分得分为69.9%，第2主成分得分为16%，两个主成分累计得分为85.9%，具有代表性。从图2-d可以看出，四甲基吡嗪与非含氮前体乙偶姻相聚较近，与含氮前体精氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸相聚较近，说明山西老陈醋酿造过程前体物质乙偶姻以及精氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸3种氨基酸与四甲基吡嗪生成具有较高相关性，该研究结果与前期分析保持一致[25]。

2.2 温度对四甲基吡嗪生成的影响

温度是影响山西老陈醋酿造过程的关键因素，其在醋酸发酵阶段的变化范围在30～45 ℃，而熏醅阶段采用较高的温度(80～110 ℃)，因此进一步分析了温度对基于乙偶姻途径的四甲基吡嗪合成的影响。如图3-a所示，各温度条件下乙偶姻含量均呈现下降趋势，在温度较低时(30、40 ℃)时，其含量下降较慢，同时，四甲基吡嗪的生成速率也较小(图3-b)。在0～1 h，随着温度的增加，四甲基吡嗪的生成速率也逐渐加快，但随后呈现下降趋势，且温度越高四甲基吡嗪含量下降的速率越大，80～95 ℃下有利于四甲基吡嗪的积累。当温度为100 ℃时，四甲基吡嗪的消耗速率达到0.33 g/(L·h)，这可能与四甲基吡嗪的挥发或者降解有关，因此进一步分析了温度对四甲基吡嗪稳定性的影响。

a-乙偶姻；b-四甲基吡嗪图3 温度对四甲基吡嗪生成的影响Fig.3 Effect of temperature on the tetramethylpyrazine formation

2.3 温度和酸对四甲基吡嗪稳定性的影响

山西老陈醋醋酸发酵和熏醅过程均以固态醋醅方式进行，温度、酸度是山西老陈醋酿造过程中变化比较大的环境参数，因此，分析了温度和酸对四甲基吡嗪稳定性的影响，结果如图4-a所示。

a-温度；b-酸图4 四甲基吡嗪稳定性分析Fig.4 Stability analysis of tetramethylpyrazine

在较低温度(30、40 ℃)条件下四甲基吡嗪含量基本不变，稳定在200 mg/L的水平。随着温度的增加，溶液中四甲基吡嗪的含量逐渐减少，且四甲基吡嗪含量降低的速率随温度的增加而增加。当温度提高至约95 ℃时，四甲基吡嗪降解速率约为10 mg/(L·h)。温度达到100 ℃时四甲基吡嗪的损失速率相对于其他温度加快，这可能与四甲基吡嗪水溶液在这一温度沸腾导致的蒸气携带损失有关。

在相同加热条件下(95 ℃)，乙酸、盐酸对溶液中四甲基吡嗪含量的影响如图4-b所示，加入盐酸的溶液中四甲基吡嗪的含量变化趋势与去离子水相近，反应结束时四甲基吡嗪含量维持在150 mg/L左右；而加入乙酸的溶液中四甲基吡嗪下降速率增加，在反应结束时其含量仅为91.35 mg/L，说明乙酸的存在增加了四甲基吡嗪的不稳定性。

2.4 熏醅温度对山西老陈醋风味的影响

分别试验了在85、95、105 ℃温度下熏醅3 d醋醅主要理化指标(总酸、总酯、氨基态氮、还原糖)和风味物质数量的差异。由图5-a可知，95 ℃条件下四甲基吡嗪的含量最高，分别比85 ℃和105 ℃高30%和17%，说明95 ℃熏醅有利于四甲基吡嗪的积累，该结果与图3和图4保持一致。与85 ℃和105 ℃相比，95 ℃条件下总酸、还原糖和氨基态氮指标无明显差异(P<0.01)，但总酯含量分别提高9%和10%(图5-b)。除醇类和酸类外，95 ℃下酯类、酮类、醛类和杂环类风味物质相对含量均有增加(图5-c)，其中总酯达到了5.28 g/100 g(图5-a)，可能是由于该温度条件有利于酯化反应的进行。在不同熏醅温度下共检测到了74种风味物质，其中酸类11种、醇类8种、酯类24种、醛类6种、酮类7种、酚类2种、杂环类16种。采用相对香气活性值法对3个熏醅温度下食醋样品的挥发性风味物质进行评价，得到图5-d所示香气轮，其中，四甲基吡嗪具有烘烤香气，而酯类化合物大多具有花果香气[28]。当熏醅温度为95 ℃时，除酸味外，奶香、烘烤香、坚果香、花果香和甜香的感官贡献率均高于其他温度条件，说明在此温度下食醋的酸味刺激感较小，口感更加柔和，食醋整体风味感官更好。

3 结论

本研究通过分析四甲基吡嗪及其主要前体化合物在山西老陈醋酿造过程的变化规律，进一步明确了山西老陈醋醋酸发酵阶段是四甲基吡嗪前体化合物代谢积累的主要阶段，熏醅过程高温条件是影响四甲基吡嗪生成与降解的主要阶段。熏醅过程中四甲基吡嗪处于生成和降解的动态平衡，高温和乙酸是导致四甲基吡嗪降解的主要原因，95 ℃有利于四甲基吡嗪以及其他风味物质的积累。研究结果进一步加深了对传统发酵食品中四甲基吡嗪这一重要风味与功能物质生成规律的认识，为山西老陈醋生产过程四甲基吡嗪这一重要特征指标化合物的控制奠定了理论基础。