基于网络药理学研究黄精丸防治阿尔茨海默病的作用机制

李 莉 李 钰 杨绍杰

1.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院·成都市妇女儿童中心医院药学部，四川成都 611731；2.西南医科大学，四川泸州 646000；3.成都市慢性病医院神经内科，四川成都 610017

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是1906年首次由德国精神病学家和神经病学家Alzheimer Alois发现，并以其名字命名的一种慢性神经退行性疾病，是老年期痴呆最常见的一种类型，也是导致老年人失能的重要原因之一[1]。据Alzheimer’s Association报道，预计到2050年AD患者将接近1.14亿，每33秒就会新增一位AD患者[2]。目前AD可能的发病机制有β淀粉样蛋白毒性学说、tau蛋白过度磷酸化学说、胆碱能学说、氧化应激学说等[3]。然而没有任何一种假说能全面解释AD所有的病理特点，目前主要认为是多种因素共同作用的结果。而目前对于AD的药物研究方面，临床上主要使用西药治疗，如胆碱酯酶抑制剂、兴奋性氨基酸受体拮抗剂、脑蛋白水解物及其他缓解AD症状的药物[4]。这些药物虽然可使患者痴呆症状相对减轻，但引发的不良事件也较多。

近年来，应用中药提取物及其衍生药物治疗AD的研究日益增多。与西药相比，我国特有的中药具有治疗效果较好、毒副作用较低等优点。据杨晶莹等[5]的研究，古方黄精丸具有潜在防治AD作用。从黄精丸防治AD相关的试验与临床研究结果来分析，黄精丸与地黄饮子[6]、开心散[7]等中药复方相似，具有多层次、多靶点、多方向防治AD的特点，而有关黄精丸防治AD的相关研究还处在空白阶段，有关该复方的相关试验及临床研究报道极少，现有的相关研究尚未完全阐明其作用机制，并且由于中药成分的多样性和作用机制的多靶点、多通路，传统的研究方法很难实施。而近年兴起的网络药理学是基于网络观点，从系统水平分析药物作用机制、发现先导化合物或新适应证、识别新药靶点的一种新的研究角度，其与中医药整体调控机体的理念相吻合，同时也能大大降低后续试验研究的工作量[8]。因此本研究将网络药理学思路应用于黄精丸防治AD的作用机制探讨，旨在为后续的试验研究方向提供一定的信息支撑，并将经典中药古方发扬光大。

1 材料与方法

1.1 分析软件及数据库

主要包括中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、DrugBank数 据 库、UniProt数 据 库、GeneCards数 据 库、OMIM数据库、String数据库、Venny 2.1、R 4.0.3、Cytoscape 3.8.1等软件。

1.2 黄精丸活性成分筛选及作用靶点预测

通 过TCMSP数 据 库[9]（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）按照如下名称：黄精（Polygonati Rhizoma）和当归（Angelicae Sinensis Radix）检索黄精丸2味中药的化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%的，类药性（drug-like index，DL）≥0.18的原则筛选[10]。利用DrugBank数 据 库（https://www.drugbank.ca/releases/latest）和Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）预测筛选、收集活性成分的潜在靶点，标准化蛋白名称，得到黄精丸活性成分的潜在作用靶点。

1.3 疾病靶点及药物与疾病靶点交集预测

以“Alzheimer’s disease”为 关 键 词，检 索GeneCards数 据 库（https://www.GeneCardssorg/）、OMIM数据库（https://omim.org/），得到AD相关的疾病基因。删除疾病靶点中多余重复的靶点，得到AD相关靶点。用韦恩图（Venny 2.1）绘制活性成分靶点和AD靶点的交集。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将药物疾病共有靶点输入String数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）构建PPI网络，生物种类设定为“Homo sapiens”。以节点连接度值（degree）为指标，筛选核心蛋白质靶标，以R 4.0.3软件绘制度值排名前20的靶点柱状图。

1.5 构建成分-靶蛋白-信号通路网络

以筛选所得的黄精丸有效成分、AD靶点及靶点所属信号通路为基础，通过Cytoscape构建成分-靶蛋白-信号通路网络，运用Tools面板中的Network analysis计算网络参数。

1.6 GO（Gene ontology）富集分析

将黄精丸防治AD的靶点信息导入Metascape平台，选择物种信息为“Homo Sapiens”，进行GO注释分析，设置阈值P＜ 0.01，筛选出排名靠前的20个GO注释结果。

1.7 KEGG（Kyoto encyclopedia of gene and genomes）通路富集

将黄精丸药物和AD交集靶点进行KEGG通路富集分析，设置P＜ 0.05，利用String数据库，使用R 4.0.3软件，绘制气泡图。

2 结果

2.1 黄精丸有效成分及其靶点

通过TCMSP数据库检索黄精丸中黄精和当归的化学成分，获得黄精有效成分38个、当归有效成分95个，按照OB值和DL值筛选活性成分，选出黄精11个、当归2个，去重后获得黄精丸的活性成分12个，见表1，最终得到黄精丸活性成分潜在作用靶点蛋白265个。

表1 黄精丸活性成分信息表

2.2 疾病靶点筛选

以“Alzheimer’s disease”为关键词在GeneCards数据库和OMIM数据库中筛选，去重后得到AD靶点基因1000个。

2.3 药物与疾病靶点交集

用韦恩图（Venny 2.1）绘制黄精丸活性成分靶点和AD靶点的交集，共92个，见图1。

图1 AD与黄精丸活性成分靶点韦恩图

2.4 PPI网络构建分析

PPI网络中共92个节点、787条边，平均度值为17.1，见图2。根据其度值筛选出排名前20位的核心靶点，包括AKT1、TP53、VEGFA、SIRT1、EGFR等，见图3。

图2 黄精丸与AD共同靶点PPI网络图

图3 黄精丸治疗AD的前20位核心靶点

2.5 药物-成分-靶点网络拓扑图

利用Cytoscape软件构建黄精丸药物-成分-靶点网络拓扑图（图4）。该网络图中包含130个节点、1252条边。在黄精丸防治AD作用网络图中，根据中心度，排名靠前的成分是 黄 芩 素（baicalein）、5，4’-二 羟 基 黄 酮（4’，5-Dihydroxyflavone）、甘 草 素（DFV）、3’-甲氧 基 大 豆 苷 元（3’-Methoxydaidzein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol），度值排名靠前的靶点有PIK3CA、PIK3CB、EGFR、NOS2、MAPK3等。

图4 药物-成分-靶点网络拓扑图

2.6 GO富集分析

GO注释分析通过共同的语义来描述基因生物学功能，GO注释结果见图5A～C。

图5 黄精丸治疗AD的潜在靶点GO富集分析

2.7 KEGG通路富集

总共富集到146条信号通路，选择排名前20的通路并以气泡图展示，见图6。排名靠前的主要有癌症信号通路、代谢通路、PI3K-Akt信号通路、神经退行性性变信号通路、AD等。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

AD病灶在脑，在中医学中属于“健忘”“呆病”等范畴，与肾虚血瘀有关[11]。《伤寒论》提到“阳明病，其人喜忘者，必有蓄血”，《类证治裁》提到“若血瘀于内，则善忘如狂”[12]。AD属本虚标实之证，本虚为肾精亏虚、气血不足致脑髓失养，标实为血瘀络滞、痰浊互结则脑脉痹阻[13]。

黄精丸中黄精可补肾填精、益气养阴、健脾润肺[14]，当归活血通络、补血和血、气畅血行[15]，全方共奏补肾填精、活血通络之功。综上所述，黄精丸用于AD防治具有扎实的中医理论依据。黄精提取物可改善AD大鼠的学习记忆，降低海马tau蛋白磷酸化[16-17]。未小明等[18]也证实黄精对AD大鼠的行为认知、学习记忆能力等有明显改善作用。另有研究显示，黄精的主要成分黄精多糖可显著保护AD大鼠的海马神经元，并可减少细胞丢失，抗神经细胞凋亡[19]。当归性温，味甘、辛，归肝、心、脾经[20]。当归具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗AD及神经保护功能[21]。吴红彦团队发现当归提取物及有效组分（当归多糖、当归挥发油及阿魏酸）可提高脑组织胆碱能神经递质、抗自由基活性，从而改善AD大鼠、小鼠的学习记忆能力[22-23]。研究发现，当归水提取物可下调糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）酶活性，进而降低tau蛋白磷酸化水平[24]。此外，当归的有效成分藁本内酯[25-26]、阿魏酸对双侧颈总动脉闭塞导致的血管性痴呆（vascular dementia，VD）大鼠也具有良好的保护作用，均可显著改善VD大鼠的学习记忆，增强其认知能力[27]。但黄精丸防治AD的物质基础和作用机制尚未明确，有待深入研究。

本研究发现黄精丸7个活性成分参与AD的治疗，其中度值排名靠前的成分是黄芩素、5，4’-二羟基黄酮、甘草素、3’-甲氧基大豆苷元、β-谷甾醇）。研究发现，黄芩素能够抑制Aβ25-35损伤的PC12细胞的氧化应激，降低毒性反应，显示黄芩素具有改善认知功能和学习记忆的能力[28]。杜烨湘等[29]的研究显示，甘草素可有效抑制AD模型细胞的炎症反应，其机制可能与其能上调ERβ蛋白的表达有关。黄芩素、5，4’-二羟基黄酮、甘草素、3’-甲氧基大豆苷元均属于黄酮类成分。黄酮类成分是在自然界大量存在的一类具有广泛活性的中药化合物，可通过抑制胆碱酯酶活性、抑制氧化应激及清除自由基、修饰tau蛋白、减少Aβ形成、抑制炎症因子表达而有效阻断AD的疾病进展[30]。而β-谷甾醇也是黄芩的有效成分，具有抗氧化作用，并通过抑制体内补体系统的激活而发挥抗炎作用[31]。上述成分可能是黄精丸治疗AD的主要药效物质基础。

PPI蛋白相互作用分析结果显示，黄精丸治疗AD的核心靶点主要有AKT1、TP53、VEGFA、SIRT1、EGFR等；药物-成分-靶点网络拓扑图中PIK3CA、PIK3CB、EGFR、NOS2、MAPK3的度值相对较大。AKT1是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，主要调控细胞的增殖和生长，参与细胞凋亡和葡萄糖代谢。TP53编码的蛋白质响应多种细胞应激，调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢改变。VEGFA是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，可促进血管内皮细胞迁移、血管新生，增加血管通透性及维护内皮细胞屏障功能。SIRT1是去乙酰化酶家族成员，通过激活过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活剂-1α（PGC-1α）参与调节组蛋白去乙酰化酶与mtDNA结合活性，参与细胞糖脂代谢、DNA损伤修复、细胞周期控制，抑制细胞凋亡和延长细胞寿命[32]。表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，可诱导受体二聚和酪氨酸自磷酸化，从而导致细胞增殖，具有神经保护作用，其下调可能与AD有关[33]。PIK3CA是一个能够磷酸化磷酸肌醇环3’OH的脂质激酶家族。其负责协调多种细胞功能，包括增殖和存活。PIK3CB在真核细胞外膜受体的信号通路中起着重要作用，并因其催化亚基而得名。编码的蛋白是PI3Kbeta（PI3Kβ）的催化亚基。PI3KB已被证明是中性粒细胞激活途径的一部分，中性粒细胞在损伤或感染部位会结合免疫复合物。NOS2是一种活性自由基，在神经传递、抗菌和抗肿瘤等多个过程中发挥生物介质的作用。MAPK3基因编码MAP激酶，MAP激酶参与多种细胞过程，是tau蛋白激酶的一种[34]，tau蛋白异常过度磷酸化是AD主要的发病机制之一，tau蛋白是脑内一种微管相关蛋白，受蛋白激酶（磷酸化）和蛋白磷酸酯酶（脱磷酸化）的调节，tau蛋白功能异常改变可能会导致神经元功能障碍和凋亡[35]。推测黄精丸可能通过降低MAPK的表达，从而减少tau蛋白的形成，减轻神经退行性变。

KEGG富集分析显示与黄精丸治疗AD相关的有癌症信号通路、代谢通路、PI3K-Akt信号通路、神经退行性性变信号通路、AD等。

本研究应用网络药理学的方法，结果显示黄精丸对AD的调控是通过多成分-多靶点-多途径的方式，为进一步研究提供了理论参考。后期可在药效学和细胞水平层面进行研究，以期进一步明确黄精丸防治AD的物质基础与作用机制。