咪唑类表面活性剂与β-乳球蛋白相互作用研究

耿斐

(山东建筑大学 学报编辑部，山东 济南250101)

0 引言

蛋白质是生物体形态结构和生命活动依赖的物质基础，是一切生物体的重要组成成分，在生命的新陈代谢和自我复制过程中起着极其重要的作用[1]。蛋白质是一类两性物质，可以与包括表面活性剂[2-3]、药物[4-5]、染料[6-7]以及金属离子[8-9]等在内的许多种类的小分子结合。 蛋白质的功能是由特定的三维空间结构决定的，与小分子的相互作用会引起其分子中各级结构的变化，导致其化学性质的变化和生物活性的丧失，最严重的还会引起变性。

乳清蛋白是一种重要的食品添加剂，已广泛应用于乳制品、肉制品和糕点等不同的领域。 β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)是由乳腺上皮细胞合成的乳蛋白， 是主要的乳清蛋白之一[10]。JELIN′SKA 等[11]应 用 泰 勒 分 散 分 析( Taylor Dispersion Analysis，TDA)研究了阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠对β-乳球蛋白的变性，根据不同表面活性剂浓度下形成的复合物的扩散系数，分析了复合物的结构变化，确定了改变蛋白质天然构象所需的表面活性剂的最低浓度。 MADADLOU 等[12]研究了乳清蛋白与低分子量表面活性剂吐温(Tween)的络合及形成的乳清-唾液蛋白聚集物的特性。Tween 将β-乳球蛋白二聚体分解为单体，降低了不溶性聚集体的大小。 此外，表面活性剂的络合作用也降低了乳清蛋白的表面疏水性和蛋白质分子间的相互作用。 DAN 等[13]研究了β-Lg 与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠混合溶液在水/空气和水/正己烷界面形成的吸附界面层的界面压力，从而考察了蛋白质/表面活性剂体系在界面上的相互作用。

现有关于β-Lg 相互作用的文献多为β-Lg 与阴离子表面活性剂及嵌段共聚物的报道[14-17]，β-Lg与阳离子表面活性剂相互作用的研究较少见。 文章通过表面张力、电导率、圆二色光谱及内源荧光光谱等手段考察了3 种咪唑类表面活性剂1-烷基-3-甲基溴化咪唑(C12mimBr、C14mimBr 及C16mimBr)与β-Lg相互作用过程中的作用方式以及β-Lg 结构的变化，补充了β-Lg 的基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

咪唑类表面活性剂1-烷基-3-甲基溴化咪唑的结构式如图1 所示。 C12mimBr、C14mimBr 及C16mimBr为依据文献[18]合成的产品，其合成过程为:在氮气保护的条件下，控制温度在75 ～80 ℃之间，甲基咪唑、过量的溴代烷烃以及乙腈搅拌回流反应48 h，旋转蒸发除去过量的溴代烷烃和乙腈；减压蒸馏以除去水，即得到最终产物。 产物经过核磁共振图谱确定其纯度。 β-Lg 购自美国默克(Sigma-Aldrich)公司。

图1 1-烷基-3-甲基溴化咪唑结构示意图

1.2 实验方法

用3 次蒸馏水分别配制了3 种咪唑类表面活性剂/β-Lg(β-Lg 为0.18 g/L)体系的溶液，未加入缓冲溶液调节pH 值。 每次实验时，测量体系的pH 值均在7～7.2 之间。 因为β-Lg 的等电点为5.3，所以实验时β-Lg 显负电性。

表面张力数值是用吊环法在JYW-200B 型表面张力仪上通过单测的方法得到的，至少测量3 次，直到测得的差值＜0.2 mN/m。 实验温度分别为25、35、45 ℃。

使用DDS-307 型电导率仪测量体系的电导率，实验温度为25 ℃。

远紫外圆二色光谱通过JASCO J-810 圆二色光谱仪进行测量。 使用1 mm 的圆形石英池，其带宽为2 nm。 通过仪器自带的Secondary structure 软件计算不同表面活性剂浓度下β-Lg 中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则蜷曲的量。 实验温度为25 ℃。

使用Perkin Elmer LS-55 荧光光谱仪进行内源荧光的测量，固定激发波长为280 nm，在295 ～440 nm范围扫描表面活性剂/β-Lg 体系的荧光光谱图。 实验温度为25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 咪唑类表面活性剂/β-Lg 体系的表面张力及电导率

分别测定了25、35、45 ℃下C12mimBr/β-Lg 体系的表面张力值，如图2 所示。 图2 中曲线出现了3 个较明显的拐点，对应的表面活性剂浓度分别称为T1、T2及 临 界 胶 束 浓 度( Critical Micelle Concentration，CMC)。 由图2 可知，温度的改变对T1及T2并没有影响。 由于温度对静电相互作用的影响很小，可知C12mimBr 在浓度为T1及T2时，与β-Lg的相互作用以静电作用为主[19]。 开始时，加入的C12mimBr 以极性咪唑头基与β-Lg 带负电的氨基酸残基相结合，曲线出现第一个拐点T1。 随着C12mimBr的逐渐加入，吸附在β-Lg 表面的表面活性剂分子增多，β-Lg 表面的吸附达到饱和。 由于β-Lg含有两个二硫键，继续加入的C12mimBr 导致β-Lg 的一对二硫键断裂，暴露出了更多的极性基团，新加入的C12mimBr 分子又能够以其极性头基吸附在这些暴露的氨基酸残基上，表面张力曲线出现第二个拐点T2。 继续加入C12mimBr 至浓度为CMC，其在β-Lg上的吸附达到饱和后，开始形成胶束。

图2 C12mimBr/β-Lg 在不同温度下的表面张力图

测定了25 ℃下3 种表面活性剂/β-Lg 体系的表面张力值，如图3 所示。 得到的T1、T2与CMC 的数值见表1。 与未加入β-Lg 相比，表面活性剂/β-Lg 体系的CMC 有显著增大，说明表面活性剂在β-Lg 上先于胶束形成发生了强烈的吸附，之后再在水中形成聚集体。

表1 25 ℃时3 种表面活性剂/β-Lg 体系的T1、T2及CMC 数值表

图3 25 ℃时3 种表面活性剂/β-Lg 体系表面张力图

测定了3 种表面活性剂/β-Lg 体系的电导率，如图4 所示。 双折线的折点对应着胶束的形成。 通过电导率曲线可以更清楚地得到β-Lg 存在时3 种表面活性剂的CMC。 C12mimBr/β-Lg、C14mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg 体系中表面活性剂的CMC 分别为0.35、0.035 及0.04 mol/L，与表面张力法得到的CMC 处于同一数量级。

反离子解离度α=胶束形成后的直线斜率/胶束形成前的直线斜率，反离子结合度β=1-α。 由图4 计算得到C12mimBr/β-Lg、C14mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg体系的反离子结合度β分别为0.19、0.28及0.40。

图4 3 种表面活性剂/β-Lg 体系电导率图

2.2 咪唑类表面活性剂/β-Lg 体系的光谱学研究

2.2.1 远紫外圆二色

表面活性剂与BSA 的相互作用会导致BSA 的结构发生一些变化，可以通过圆二色光谱检测BSA二级结构的改变。 在圆二色光谱上，α-螺旋结构的特征峰表现为208 及222 nm 附近的两个负槽，β-折叠结构的特征峰表现为215 nm 附近的负槽。 因为β-Lg 中β-折叠构象的量远超过α-螺旋构象的量，所以圆二色图谱的负槽出现在215 nm 附近。

表面活性剂/β-Lg 体系随表面活性剂浓度变化的远紫外圆二色光谱如图5 所示。 在图5(a)中，当C12mimBr 浓度逐渐增加到3×10-5mol/L 时，β-Lg的β-折叠的量显著降低，二级结构完全被破坏。 在图5(b)和(c)中，当C14mimBr、C16mimBr 的浓度分别增加到1×10-4mol/L 时，完全破坏了β-Lg 的二级结构。 结合表面张力结果可知，此时的表面活性剂浓度＞T1，β-Lg 的一个二硫键断裂，三级结构改变的同时二级结构也遭到了破坏。 通过圆二色结果可知，咪唑类表面活性剂对β-Lg 的二级结构有较大的破坏性，很低的浓度就能造成β-Lg 结构的改变。

图5 3 种表面活性剂/β-Lg 体系远紫外圆二色光谱图

2.2.2 内源荧光

表面活性剂/β-Lg 体系中β-Lg 的内源荧光随表面活性剂浓度的变化如图6 所示。 色氨酸残基的荧光光谱对微环境的变化很敏感，其峰位一般在325～350 nm 之间变动。 由图6 可以看出，β-Lg 的荧光发射峰位于350 nm 附近，是色氨酸残基的特征荧光光谱。 β-Lg 的最大荧光发射峰峰位置并不随着表面活性剂浓度的增加而改变，说明表面活性剂没有造成色氨酸残基周围微环境的改变，没有与色氨酸残基发生结合。 C12mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg 体系最大荧光发射峰峰值随着表面活性剂的加入出现了先增大后减小的现象，说明色氨酸残基的溶解度发生了变化。 当加入的表面活性剂浓度较低时，造成色氨酸残基溶解度变大，最大荧光发射峰峰值变大，随着表面活性剂浓度的进一步增大，色氨酸残基溶解度变小，最大荧光发射峰峰值变小。C14mimBr/β-Lg体系最大荧光发射峰峰值随着表面活性剂的加入逐渐变小，说明随着C14mimBr 的加入，色氨酸残基溶解度逐渐变小。

图6 3 种表面活性剂/β-Lg 体系内源荧光光谱图

3 结论

通过上述研究，得到以下结论:

(1) 咪唑类表面活性剂1-烷基-3-甲基溴化咪唑与β-Lg 的作用方式与表面活性剂的浓度有关。当表面活性剂浓度较低时，作用方式为静电相互作用，表面活性剂的加入导致β-Lg 中的二硫键断裂，表面活性剂进一步与二硫键断裂后暴露出的氨基酸残基作用；当表面活性剂浓度较高时，作用方式为疏水相互作用，且相互作用对CMC 的影响很大。

(2) C12mimBr/β - Lg、 C14mimBr/β - Lg 及C16mimBr/β-Lg体系的反离子结合度分别为0.19、0.28 及0.40。

(3) C12mimBr、C14mimBr、C16mimBr 分别在3×10-5、1×10-4、1×10-4mol/L 造成了β-Lg 二级结构的改变，但表面活性剂不与β-Lg 上的色氨酸残基直接作用。