基于网络药理学探讨茵栀黄口服液治疗黄疸的作用机制研究

王炳然 张立平 彭 龙

(1 北京中医药大学，北京，100029； 2 北京中医药大学第二临床医学院东方医院，北京，100078)

黄疸(Jaundice)又称高胆红素血症(Hyperbilirubinemia)，是指由于血液中发生过量的胆红素积聚而导致的身体组织黏膜的黄染。其中以巩膜的黄染最先出现，因巩膜含有较多的弹性蛋白，与胆红素具有较高的亲和力[1]，随着血清胆红素水平的进一步提高，皮肤、黏膜及其他组织逐渐变为黄色。黄疸的发生在不同年龄的人群中差异较大，其中以新生儿及老年人更易出现[2]。目前治疗黄疸的化学药物较少，而使用中药治疗临床效果较明显，黄疸的病机主要可概括为湿邪阻滞、瘀热内结、风邪外袭、脾胃虚寒等。茵栀黄口服液作为临床上广泛应用的具有退黄作用的中成药，对新生儿黄疸、胆汁淤积性黄疸等均有显著的疗效[3-5]，中药及其复方在治疗黄疸方面具有独特的优势。

茵栀黄口服液的主要成分包括茵陈、栀子、黄芩和金银花。茵陈具有清热解毒、利胆、保肝、抗病毒等作用[6]；栀子具有凉血解毒、活血化瘀、利胆等作用[7]；黄芩具有清热解毒、利胆、抗炎、抗氧化等作用[8]；金银花具有清热解毒、保肝利胆、抗氧化、抗血小板聚集等作用[9]。然而目前对其治疗黄疸的作用机制研究较少，因此，探讨分析茵栀黄口服液的有效成分、作用靶点及其可能的作用机制，有利于对其科学内涵的阐释和临床应用的推广。本文通过网络药理学预测茵栀黄口服液可能的活性成分，并通过化合物相似性分析和蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络分析等手段，探讨茵栀黄口服液治疗黄疸的主要活性成分、重要靶点及相关通路。

1 资料与方法

1.1 茵栀黄口服液的有效成分和靶点筛选 利用中药系统药理数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)对茵栀黄口服液的4种成分进行筛选[10]。以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18作为筛选条件[11]，利用TCMSP对有效成分作用靶点加以预测。

1.2 有效成分-靶点网络的构建 “有效成分-靶点网络”的构建和分析主要通过Cytoscape 3.7.2进行，用“节点”(Node)表示成分、蛋白，用“边”(Edge)表示成分之间的相互作用关系[12]；用Network Analyzer插件进行网络特征分析，节点的度值(Degree)表示网络中与该节点相连节点的数量，一般来说，节点的度值越大则越可能是化合物的关键靶点。

1.3 疾病相关靶点的筛选 将“jaundice(黄疸)”作为关键词，对3个常用数据库：GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)进行已知疾病的靶点检索及筛选，并删除检索结果中重复的靶点，整理后建立黄疸相关靶点数据集。对比分析药物化学成分作用靶点与黄疸相关靶点，得到药物与疾病的交集靶点。

1.4 PPI网络的构建 将上述得到的交集靶点录入STRING平台(https://string-db.org/)获得PPI网络，再将PPI网络导入Cytoscape 3.7.2，利用MCODE插件进行分析，得到潜在的蛋白功能模块，并对其参与的生物学进程进行功能描述。利用Cytoscape 3.7.2对有效成分及潜在靶点的关系网络进行绘制和分析，确定茵栀黄口服液中发挥重要作用的成分和靶点，根据不同靶点与成分的对应关系进行分类展示。

1.5 靶点功能与通路的富集分析 将茵栀黄口服液治疗黄疸的靶点录入有详尽的功能注释并且定期更新基因和蛋白数据的Metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html)[13]，进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，设置P<0.01，分别选择生物过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)3个模块的前10个条目录入微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)对数据进行可视化。基于通路映射靶标，使用Cytoscape 3.7.2构建“靶点-通路”网络以进一步筛选茵栀黄口服液治疗黄疸的关键靶点。

1.6 分子对接验证 利用AutoDock Vina 1.1.2软件对PPI网络中的关键靶点蛋白与入血的关键成分进行分子对接验证。从RCSB PDB数据库和PubChem数据库中获得关键靶点的三维结构，应用AutoDock Tools 1.5.6对上述靶点蛋白的受体和配体进行常规处理,再利用插件AutoGrid将得到的对接活性位点进行分子对接,选取对接结合能(Affinity)最低的构象进行对接结合模式分析，并使用PyMOL完成作图。

2 结果

2.1 茵栀黄口服液的有效成分和靶点筛选 通过对TCMSP数据库中茵栀黄口服液所有已收录的成分及其药物动力学(Absorption and Distribution and Metabolism and Excretion，ADME)参数的相关检索，共搜集到相关成分530个。在OB≥30%，DL≥0.18的筛选条件下检索TCMSP数据库共搜集到有效成分87个，其中包含相关靶点的有效成分共36个。利用TCMSP靶点预测模型对有效成分作用靶点加以预测，排除重复靶点，共获得预测靶点233个。见图1、表1。

图1 根据ADME参数筛选出茵栀黄口服液有效成分

表1 茵栀黄口服液的有效化学成分

2.2 茵栀黄口服液“有效成分-靶点”网络的构建和分析 共得到273个节点(包含233个靶点、36个有效成分和4个中药)和825条关系，其中节点的大小与该节点的Degree值正相关，而Degree值越大代表生物学重要性越强。见图2。

图2 茵栀黄口服液的有效成分-靶点网络

2.3 黄疸相关的疾病靶点检索 去掉重复后共得到2 039个已知的靶点。

2.4 茵栀黄口服液治疗黄疸的PPI网络的构建 将茵栀黄口服液的成分靶点与黄疸的疾病靶点取交集后，得到了交集靶点的PPI网络。见图3。其中橙色靶点如IL-6、TNF、MAPK1、MAPK8等被认为在茵栀黄口服液治疗黄疸的过程中具有重要的功能。对PPI网络中的靶点相互作用关系进行分析，得到了Module，即更具有生物学意义的集合。见图4。根据P值，保留PPI网络与Module中3个评分最高的生物学进程。见表2。

图3 茵栀黄口服液治疗黄疸的靶点PPI网络

图4 茵栀黄口服液治疗黄疸的靶点PPI网络中潜在Module网络

表2 茵栀黄口服液治疗黄疸的靶点PPI网络中潜在Module功能描述(前3位)

2.5 富集分析结果

2.5.1 GO富集分析 主要的BP有对无机物和脂多糖的应答、对凋亡的调控；MF主要集中在调控细胞因子受体结合和对多种蛋白激酶活性的调节；CC则集中在膜筏、蛋白激酶复合物及囊腔结构。见图5。

图5 GO功能富集分析

2.5.2 KEGG富集分析 “靶点-通路”网络共有20条信号通路、109个基因和614条关系，主要涉及以下通路：丙型肝炎、T细胞受体信号通路、IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路、甲状腺激素信号通路、核因子κB信号通路等；具有较大Degree值的靶点TNF、MAPK8、MAPK1、PRKCA、IL6、BAX、AKT1、TGFB1等可能是茵栀黄口服液治疗黄疸的核心靶点。见图6。

图6 茵栀黄口服液治疗黄疸的靶点-通路网络

2.6 分子对接结果分析 结果显示，结合能均小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)，受体与配体能够自发结合，并且具有较强的结合活性。见图7。结合能力最强的是TGFB1和木犀草素。见图8。

图7 分子对接结果

图8 TGFB1与关键活性成分结合模式

3 讨论

“黄疸”一词最早见于《黄帝内经》：“身痛而色微黄，齿垢黄，爪甲上黄，黄疸也。”“溺黄赤安卧者，黄疸也”“目黄者，曰黄疸”“湿热相交，民当病疸。”中医学将黄疸归纳为一种以目黄、身黄、小便黄为主要特性的疾病。现代药理学研究证实，胆红素代谢异常是导致黄疸发生的主要病因，目前临床上治疗黄疸的化学药物较少，而茵栀黄口服液具有消退黄疸和降低谷丙转氨酶的作用，对慢性病毒性肝炎、肝细胞性黄疸、新生儿黄疸等均有较好的疗效[14]。茵栀黄口服液由茵陈、栀子、黄芩和金银花4味药组成，其中茵陈为君药，栀子、黄芩为臣药，3药配伍，加强了清热利湿，解毒退黄的作用，又佐以能清热解毒，消肿败毒的金银花，得以共奏利湿退黄，清热解毒之功。

通过对茵栀黄口服液治疗黄疸的主要活性成分、靶点和通路进行分析，筛选出主要活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩素等。相关研究证实，槲皮素能够增加肝细胞对血液中胆红素的摄取功能，减少胆红素对器官造成的损伤，对肝损伤起到较好的修复作用，同时，槲皮素可通过增加法尼酯X受体(Farnesoid X Receptor，FXR)的表达量来诱导胆盐输出泵(Bile Salt Export Pump，BSEP)与多药耐药蛋白2(Multidrug Resistance Proteins 2，MRP2)的表达，加速胆酸盐的排泄[15]；山柰酚可以通过调节核因子κB信号通路来减轻肝脏的炎症反应，从而进一步改善肝脏损伤，达到保护肝脏的作用，同时，山柰酚能够提高发生内质网应激的肝细胞生存率，减少肝细胞乳酸脱氢酶的释放，抑制内质网应激诱导的CCAAT/增强子结合蛋白-同源蛋白(C/Enhancer-Binding Protein-Homologous Protein，CHOP)的表达，从而减轻肝细胞的凋亡[16-17]；木犀草素能够降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平下降，使血红素氧合酶-1表达明显升高，增强机体的抗氧化性，减轻组织的氧化损伤，缓解肝损伤[18]；Shi等[19]研究表明黄芩素能够诱导核因子-红系2相关因子(Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2，Nrf2)的活化，并增加其下游抗氧化基因的表达，发挥对对乙酰氨基酚诱导的肝毒性的保护作用。

同时，研究结果表明，茵栀黄口服液治疗黄疸的主要靶点可能是TNF、MAPK8、MAPK1、PRKCA、IL-6、BAX、AKT1、TGFB1等。有研究表明，在梗阻性黄疸大鼠模型中，肿瘤坏死因子-α会通过多种途径激活中性粒细胞使之向肝窦内皮黏附并穿过、激活凝血系统导致肝内毛细血管中血栓形成、激活肝内的磷脂酶，分解磷脂为花生四烯酸，而产生对肝细胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，同时，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和血小板活化因子可协同作用而导致肝细胞损伤[20]。促分裂原活化的蛋白激酶可以调节肝脏组织的氧化还原反应、介导炎症反应，间接对肝细胞损伤起到改善作用[21]。蛋白激酶Cα(Protein Kinase C alpha，PRKCA)能够通过阻断P53的诱导保护细胞免于凋亡，并且能通过诱导κB抑制物(Inhibitor of KappaB，IκB)来下调核因子κB介导的多种炎症反应相关基因的表达[22]。B细胞淋巴瘤-2相关X(B-cell Lymphoma-2 Associated X，BAX)蛋白可以引起细胞线粒体膜的破坏，导致细胞色素C释放，进而激活凋亡执行蛋白胱天蛋白酶-3，引起细胞凋亡[23]。研究发现，梗阻性黄疸发生时磷酸化-蛋白激酶B(p-Protein Kinase B,p-AKT)蛋白表达水平会应激性增高，AKT能够激活下游通路发挥抗氧化、保护肠黏膜屏障的作用[24]。转化生长因子B1(Transforming Growth Factor Beta 1,TGFB1会影响正常肝细胞和受损肝细胞的纤连蛋白生成，导致肝细胞和导管再生并增加肝组织中的细胞外基质，对黄疸导致的肝损害起到保护作用[25]。以上研究表明，茵栀黄口服液可以通过多靶点对黄疸起到调治作用。

从富集分析结果可知，茵栀黄口服液可以通过多种途径发挥对黄疸的治疗作用：1)改变胆红素代谢。主要与甲状腺激素信号通路相关。甲状腺激素具有调节物质代谢的作用，有研究发现，采用外源性甲状腺激素能够改善梗阻性黄疸大鼠的甲状腺激素水平异常，调节梗阻性黄疸大鼠胆红素的代谢，在减轻肝组织损伤的同时改善肝组织的合成功能，发挥对肝组织的保护作用[26]。2)减轻对肝组织的损伤。主要与PI3K-AKT信号通路、核因子κB信号通路、T细胞受体信号通路、IL-17信号通路等相关。PI3K-AKT信号通路在细胞中普遍存在，它参与体内炎症反应、细胞代谢、增殖、分化、凋亡等多个重要的生理过程[27]。有研究显示，由于梗阻性黄疸会导致肺通气功能降低，PI3K-AKT信号通路可通过缺氧诱导因子-1上调Toll样受体4的表达，从而增加炎症反应和组织损伤[28-29]；同时有实验表明，地塞米松可能通过激活PI3K-AKT信号通路改善梗阻性黄疸诱导的肝组织损伤，减少肝细胞凋亡，发挥对肝组织的保护作用[30]。核因子κB信号通路的活化与机体炎症有密切关系，并会参与抗原递呈、炎症介质释放、免疫激活等过程[31]。有研究表明，在梗阻性黄疸发生时，肝组织中核因子κB通路的关键蛋白表达增加，肝细胞凋亡指数上升，肝组织损伤加重[32]。T细胞受体(T Cell Receptor，TCR)能够通过与共刺激分子CD226的信号转导协同作用，使酪氨酸磷酸化触发VAV1(vav鸟嘌呤核苷酸交换因子)的激活，来正向调节CD4+T细胞产生白细胞介素-7等细胞因子[33]，白细胞介素-17是由CD4+T细胞分泌的一种重要的炎症介质，可诱导炎症介质，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、趋化因子等表达，并介导中性粒细胞在肝脏的浸润，导致肝脏发生炎症反应和组织损伤[34]，在胆汁淤积过程中，白细胞介素-17可能会增强肝细胞对胆汁酸诱导的炎症介质的产生，进而在正反馈通路中诱导Th17细胞肿胀[35]。

综上所述，胆红素的代谢是一个复杂的生理过程，有多种酶、转运体及细胞因子参与，当参与胆红素生物转化的因子出现异常时，可能会引起胆红素代谢异常，导致黄疸等疾病的发生[36]。因此，在治疗时应针对病因、机体内环境、代谢过程等，进行多系统、多靶点的干预，这正与中医理论中整体观念、辨证论治、根据标本缓急进行治疗的理念相吻合。故应用网络药理学研究中药复方“多成分、多靶点、多通路”的特点，既能在分子水平上理解疾病发生发展的机制，又能系统分析和预测作用机制，为后续的验证和优化实验设计提供重要依据。