具核梭杆菌通过其毒力因子LPS激活TLR4/MYD88/NF-κB通路促进食管鳞癌增殖

唐 帅，张桂生，黄杨文，3，朱慎钰，曾雪亮，何 新，3

（1. 赣南医学院第一附属医院龙南分院内3科；2. 赣南医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科；3. 国家老年疾病临床医学研究中心江西省分中心；4. 赣南医学院第一附属医院胸外科；5. 赣南医学院第一附属医院药剂科，江西赣州 341000）

食管癌的发病率和死亡率分别位列恶性肿瘤的第六和第四位［1］，已成为严重威胁我国人群健康的疾病之一。食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌是食管癌的2种主要病理亚型，我国以ESCC 为主［2］。目前，绝大多数ESCC患者在临床确诊时已是中晚期，失去了治愈机会，五年生存率不足20%［3］。ESCC 的病因尚不清楚，既往研究表明，高温饮食或饮酒引起的慢性食管损伤、食管炎症和基因表达的改变都可能和食管恶性肿瘤发生相关［4-5］。近年来，随着对微生态学的深入研究，菌群失调已成为影响肿瘤发生、发展的重要因素之一。

健康的食管菌群是保持食管正常功能的重要因素之一，食管中有34个细菌属被发现相对丰度＞1. 0，其中链球菌属和厌氧菌是主要的优势菌属，占微生物群的16%至70%［6-7］。食管菌群失调可以导致多种疾病的发生，包括食管相关疾病（食管炎、Barrett 食管和食管肿瘤等）和食管外疾病（糖尿病、哮喘、间质性肺炎等）［8］。具核梭杆菌是一种口腔中的厌氧革兰氏阴性菌，该菌的慢性感染与多种癌症（口腔鳞癌、胰腺癌和大肠癌）发生、发展有密切关系［9-10］。具核梭杆菌可通过其表面的3 种生物分子，即脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、黏附素A（Adhesin A，FadA）和梭杆菌自转运蛋白-2（Fusobacterium autotransporter-2，Fap2）促进大肠癌的发生和发展［11］。具核梭杆菌在大肠癌发生、发展中的作用机制已有相关文献报道，然而具核梭杆菌和ESCC 发生、发展之间的关系国内外至今未见报道。本研究旨在阐明具核梭杆菌促进ESCC 增殖的分子机制，为ESCC 的早期预测诊断和预防提供可能靶细菌和肿瘤生物标志物，并为ESCC 的治疗提供可能的靶标，为ESCC 的早期诊断和治疗提供新的方法和理论依据。

1 材料与方法

1. 1 临床样本的16S rRNA 测序本研究选取病理确诊的25 份ESCC 组织样本及作为对照的25 份健康人组织，提取基因组DNA 并使用通过PCR扩增16S rRNA 基因的高变V4 区，引物序列为515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' 和 806R： 5'-GGACTACNNGGGTTATCTAAT-3'。本研究经患者及家属同意并签署知情同意书，并已获得我院人与动物护理和使用机构委员会的批准。

1. 2 细菌和细胞培养具核梭杆菌ATCC25586、溶血孪生球菌ATCC10379 被选为实验细菌。具核梭杆菌ATCC25586 在Wilkins 培养基、溶血孪生球菌ATCC10379 在血琼脂平板中分别在37 ℃厌氧条件下培养2 d。人食管癌细胞株TE-1 和EC18 由上海北诺生物科技有限公司提供。TE-1 和EC18 细胞重悬于含10%胎牛血清和5 000 U·mL-1青霉素/链霉素的RPMI1640 培养基中，置于37 ℃5% CO2的培养箱中培养。

1. 3 具核梭杆菌ATCC25586 感染人食管癌细胞株TE-1 和EC18具核梭杆菌接种在Wilkins 培养基中，并在37 ℃含有5% CO2和95% N2的厌氧培养箱中培养。具核梭杆菌振摇过夜，收集加入1 mL 1×PBS 后在培养基中轻轻刮下接种环上的菌落，EP管中菌悬液制备好并吹匀，然后在96 孔板中加入100 µL 菌悬液。通过酶标仪检测菌悬液的OD 值（定义1 OD 值大约等于108CFU·mL-1），使用含有10% 胎牛血清的RPMI1640 培养基制备1011·L-1的细菌溶液。TE-1 和EC18 细胞接种于2×10 个/孔的12孔板培养待细胞融合度达80%～90% 时用于实验，PBS 洗涤细胞，使用不含链霉素和青霉素的RPMI1640 培养基代替生长培养基培养1 h，用PBS洗涤细胞3 次，向细胞中加入细菌溶液培养24 h 进行感染实验。在随后的所有实验中，将细胞分为2组并分别用具核梭杆菌［感染复数（MOI）=200］和溶血孪生球菌（MOI=100）进行感染，溶血孪生球菌作为对照菌。

1. 4 3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2H-溴化四唑测定（MTT 实验）TE-1 和EC18 细胞用具核梭杆菌或溶血孪生球菌感染24 h，接种在96 孔板中，并在指定的时间点用100 µL无菌MTT染色液在37 ℃下染色4 h，去除培养基，然后加入150 µL 二甲亚砜，在570 nm处测量吸光度。

1. 5 软琼脂克隆形成实验将TE-1 和EC18 细胞用具核梭杆菌或溶血孪生球菌感染24 h，取对数生长期细胞用0. 25% 胰蛋白酶消化并轻轻吹打，用含20% 胎牛血清的培养液调整细胞密度至1×106·L-1。铺下层胶：按1∶1 比例将1. 2% 的琼脂糖胶和2×DMEM 培养基（含有2×抗生素和20% 的小牛血清）混合后，分别取3 mL 混合液注入直径6 cm 平皿中，室温等待平皿中混合液冷却凝固。铺上层胶：按1∶1比例将0. 7% 的琼脂糖和2×DMEM 培养基在无菌试管中，再向管中加入0. 2 mL 的细胞悬液，混合均匀后，注入铺有1. 2% 琼脂糖底层平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37 ℃5%CO2温箱中培养10 d。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。

1. 6 蛋白质印迹分析实验TE-1 和EC18 细胞在感染具核梭杆菌或溶血孪生球菌24 h 后进行蛋白提取和BCA 定量，根据BCA 定量结果进行上样，通过SDS-PAGE 分离等量的总蛋白，电转移PVDF 膜上，并在4 ℃下与一抗TLR4（1∶1 000）、MYD88（1∶1 000）、C-myc（1∶1 000）、CyclinD1（1∶1 000）、NF-κB（标准化为NF-κB/P65 及P50，1∶1 000）、GAPDH 多克隆抗体（1∶1 000）孵育过夜，室温与二抗A9169 和A9044（1∶5 000）孵育1 h，洗膜4次，每次15 min。将混合好的显影液滴上PVDF膜上，进行显影。

1. 7 统计学方法用SPSS 22. 0 软件对数据进行分析，由均数±标准差表示处理后的数据，用单因素方差分析进行组间比较，P＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 具核梭杆菌在ESCC 患者肿瘤组织中明显富集使用Illumina Hiseq2500 PE250 系统对25 例ESCC患者和25例健康人（HS）的食管鳞癌组织细菌进行16S rRNA 基因测序分析。共生成了3 411 301个过滤序列。每个样本观察到的操作分类单位（OTU）数量的曲线显示，观察到OTU 平均数达到大约25 000 个序列读数的平台表明每组中呈现的大约所有OTU 都被检测到并且足以识别大多数每个食管微生物组的细菌群落成员（图1A）。在属水平上，ESCC 患者食管中链球菌（Streptococcus）、梭杆菌（Fusobacterium）、奈瑟菌（Neisseria）、溶血孪生球菌（Gemella）、普雷沃菌（Prevotella）等菌为优势菌；健康对照组食管中链球菌（Streptococcus）、盐单胞菌（Halomonas）、普雷沃氏菌（Prevotella）、具核梭杆菌（Fusobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）等为优势菌（图1B）。ESCC 食管细菌的微生物组与健康对照显著不同，其中具核梭杆菌（P=0. 005）、溶血孪生球菌（P=0. 018）在ESCC 食管组织中含量最丰富（图1C）。

图1 ESCC患者食管组织菌群的丰度

2. 2 具核梭杆菌对ESCC 细胞增殖的影响选取在食管鳞癌组织和健康人群组织中差异聚集具有统计学意义的溶血孪生球菌及PBS进行对照。细胞集落形成实验显示：与加入溶血孪生球菌及PBS 相比，加入具核梭杆菌刺激后，TE-1 和EC18 细胞的生长速率明显增强（图2A）。同时，MTT 测定也显示，与加入溶血孪生球菌及PBS 相比，加入具核梭杆菌刺激后，TE-1 和EC18 细胞的生长速率明显增强（图2B、2C）。

图2 具核梭杆菌对ESCC细胞增殖的影响

2. 3 具核梭杆菌可能通过LPS 激活TLR4/MYD88/NF-κB 通路促进食管鳞癌的增殖集落形成实验显示，与加入TLR4 通路抑制剂TAK-242 及PBS 组相比，加入具核梭杆菌或分离提取具核梭杆菌的脂多糖（LPS）刺激后，TE-1 和EC18 细胞的生长速率明显增强。同时，MTT 测定也显示，与加入TLR4通路抑制剂TAK-242及PBS组相比，加入具核梭杆菌或分离提取具核梭杆菌的脂多糖（LPS）刺激后，TE-1和EC18细胞的生长速率明显增强（图3）。Western Blot 实验结果显示，与加入溶血孪生球菌及PBS 相比，加入具核梭杆菌刺激后，TLR4、MYD88、p-P65及p-P50表达上调；同时，与增殖相关的C-MYC、CyclinD1表达也上调（图4）。

图3 具核梭杆菌可能通过LPS影响食管鳞癌细胞增殖

图4 具核梭杆菌感染后，TLR4/MYD88/NF-κB通路相关蛋白的表达变化

3 讨论

具核梭杆菌在牙周炎、阑尾炎、牙龈炎和头部、颈部、肺部、肝脏、心脏等感染中起重要作用［12-14］，同时具核梭杆菌的慢性感染与多种肿瘤（包括口腔鳞癌、胰腺癌和大肠癌）发生、发展有密切关系［10］。具核梭杆菌在食管鳞癌细胞增殖过程中的具体机制目前仍不清楚。GUO S H 等［15］研究发现，具核梭杆菌可通过外泌体携带miRNA 促进大肠癌转移。ABED J等［16］研究证实，Fap2能通过识别大肠癌细胞表面因子Gal-GalNAc 促进大肠癌细胞转移。本研究探讨了具核梭杆菌通过其毒力因子LPS 激活TLR4/MYD88/NF-κB 通路促进食管鳞癌增殖的分子机制。首先，我们通过16S rRNA 测序分析了25 例食管癌患者及25例健康对照组的细菌群落组成，结果表明，ESCC 食管细菌的微生物组与健康对照显著不同，其中，具核梭杆菌、溶血孪生球菌在ESCC食管组织中含量最丰富。进一步研究发现，与加入溶血孪生球菌及PBS相比，加入具核梭杆菌刺激后，TE-1 和EC18 细胞的生长速率明显增强，说明具核梭杆菌可能是一种特异的致病菌。YAMAMURA K等［17］研究证实了具核梭杆菌在食管鳞癌组织中出现明显富集，且对食管鳞癌患者的生存时间产生了显著影响。该研究和我们研究结果一致，提示具核梭杆菌在ESCC的发生、发展过程中起重要作用。

消化道细菌菌群失调导致恶性肿瘤的发生、发展已有研究证据，比如幽门螺杆菌和胃癌、具核梭杆菌与大肠癌的发生都密切相关［18-19］。有学者研究报道，具核梭杆菌可通过其LPS与TLR4结合促进大肠癌的发生、发展［20］。LPS 作为具核梭杆菌最为重要的毒力因子之一，在结直肠癌、胰腺癌和口腔癌鳞状细胞癌中可以作用TLR4，促进正常上皮细胞向肿瘤细胞的转变［10］。TLR4 通过MYD88 激活NFκB通路促进大肠癌的发生、发展已被报道［21］，那么具核梭杆菌能否通过TLR4/MYD88/NFκB 通路调控食管鳞癌细胞的增殖？我们分别使用TLR4 通路抑制剂TAK-242 及单独加入分离提取具核梭杆菌ATCC25586 的脂多糖（LPS）刺激人食管鳞癌细胞株TE-1 和EC18 细胞进行相关实验［22］。MTT 及集落形成实验表明，加入具核梭杆菌的LPS 可以促进食管鳞癌细胞的增殖。Western Blot 实验表明，具核梭杆菌可以上调TLR4/MYD88/NF-κB通路相关蛋白的表达。本研究主要从细胞水平研究具核梭杆菌可能通过LPS 激活TLR4/MYD88/NF-κB 通路促进食管鳞癌的增殖。ABI A 等［23］曾报道LPS 能通过TLR4 途径调控环状RNA 的表达。FAN L 等［24］也证实环状RNA 可用于ECSS 诊断或预后预测的生物标志物，同时也可用于治疗ESCC 的靶点。但是，具核梭杆菌是否也会通过其毒力因子LPS 调控环状RNA 的表达促进食管鳞癌细胞增殖，目前尚不明确。本课题组下一步研究的方向，需确定具核梭杆菌是否可通过其毒力因子LPS 调控环状RNA 的表达来促进食管鳞癌细胞的增殖，为食管鳞癌的预防和早期诊断寻找到可供干预的靶标。