人脐带间充质干细胞治疗胰腺损伤的研究进展

韩 丽，陈思平，周世波，周黎晨，赵治戎，吉 华，戴睿武

1.西南交通大学医学院，成都 610031；2.中国人民解放军西部战区总医院普通外科，成都 610083

胰腺损伤是现代交通事故、灾害条件下因创伤所致的一类伤情事件，由于其并发症多、病死率高，成为现代急救医学研究的热点和难点。但目前，有关胰腺毁损组织的修复机制以及后续内分泌细胞损伤有效抑制措施的研究仍较为缺乏[1]。胰腺作为腹膜间位器官，位于腹腔内多种脏器的深面，由于其特殊的解剖位置，损伤后不易发现，常延误最佳治疗时机，加之其富含大量胰源性消化酶，可以引起创伤后再次损伤效应[2-3]。其次，胰腺损伤发生后胰酶过度激活，胰腺组织修复缓慢甚至停滞，极易出现胰腺及胰周组织坏死等严重的局部和全身并发症，常危及生命[4-5]。如何突破这一治疗瓶颈，已成为临床亟需解决的问题。

胰腺损伤后，损伤组织再生修复过程涉及细胞间相互作用、组织转化、再分化、信号通路参与、转录因子调控、基因表达等多个阶段，是一个复杂的过程[6-7]。近年来，再生医学受到了越来越多的关注。干细胞治疗是一种有效的组织再生策略，对损伤组织的再生和修复有积极的治疗作用。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有多向分化潜力、定向迁移、组织修复及抑制炎症损伤和再生特性的干细胞。其次，MSCs还具有较低的免疫原性和免疫调节能力，可以从骨髓、脂肪、脐带等组织中获取[8-9]。目前，已有国内外学者将MSCs应用于治疗不同组织疾病取得了良好的结果[10-12]。而人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)作为MSCs中的一种，拥有获取方便、免疫原性低、细胞原始、免疫调节等明显优势，成为近年来的研究热点[13-14]。且HUC-MSCs内含有多种成分,可以通过不同的方式调节损伤后的炎症反应、血管生成和细胞保护，参与生物学发育、表观遗传调控、免疫调控、肿瘤发生进展等生理和病理过程。本文就HUC-MSCs的生物学特性、功能优势,对胰腺损伤动物模型的应用及发挥治疗作用可能涉及的潜在机制方面进行探讨，为探索胰腺损伤临床治疗新策略作出有益尝试。

1 HUC-MSCs的生物学特性及功能优势

HUC-MSCs可从脐带的华通氏胶(Wharton’s jelly,WJ)[15]、静脉内皮、血管周围区域分离出来[16]。其具有分化成肌肉、成骨、软骨、脂肪、胰岛、血管内皮、心肌等细胞的能力。相比其他组织来源的MSCs，HUC-MSCs有以下优点：(1)可以表现出MSCs表面特异性抗原CD29、CD73、CD90，并且具有易于获得和伦理问题较小的优势[17]；(2)收集无侵入性，可以预防感染的风险；(3)相比其他组织来源的MSCs表现出更高的增殖潜力；(4)由于主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex I,MHC I)类表达较低，MHC Ⅱ类分子缺失，在早期的胚胎学阶段显示出更高的分化能力和更快的自我更新；(5)可以冷冻储存、解冻、恢复和扩展，以供随时治疗使用[18]。这些优势使HUC-MSCs具有广阔的应用前景。

2 HUC-MSCs在胰腺损伤治疗中可能发挥的潜在的机制探讨

2.1细胞凋亡 细胞凋亡是一个以线粒体渗漏、功能障碍和凋亡信号通路激活为特征的过程。在创伤过程中，多个细胞死亡途径被启动，触发瘢痕的形成和组织重塑。防止细胞凋亡和增加细胞存活对于组织修复和维持器官稳态至关重要。大量研究证实，胰腺凋亡和坏死广泛存在于胰腺腺泡细胞中，与胰腺损伤发展过程中的器官损伤密切相关。HUC-MSCs可通过调控多种信号通路参与调节细胞凋亡，促进损伤组织修复再生，从而改善胰腺损伤组织功能[19]。Zhou等[20]通过观察HUC-MSCs对卵巢癌细胞(SKOV3)增殖和凋亡的影响发现，HUC-MSCs可以体外靶向卵巢癌细胞，通过调节肿瘤增殖抗原(Ki-67)的表达抑制SKOV3细胞的增殖，并通过调节B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2基因关联X 蛋白(Bax)的表达促进SKOV3细胞的凋亡。Nie等[21]在2型糖尿病大鼠模型和高糖脂肪刺激的人肾小球系膜细胞(hGMC)模型中验证了HUC-MSCs可以通过激活转录因子核因子E2相关因子(NF-E2)和相关因子(Nrf2)及其上游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路来减轻2型糖尿病肾氧化损伤和细胞凋亡，展现出了HUC-MSCs作为治疗糖尿病肾病药物靶点的潜力。Zhang等[22]证实HUC-MSCs可能通过调节细胞外调节激酶(ERK1/2)信号传导和诱导心肌细胞凋亡两种方式来减轻急性心肌炎大鼠模型中的心肌损伤和功能障碍，从而减弱炎症细胞的浸润和不良的心脏重塑。在胰腺损伤发生的早期(6h内)，胰腺凋亡细胞逐渐增加，随着时间的推迟，凋亡小体逐渐形成并不断清除，代偿性地抑制细胞凋亡的机制,对机体损伤起到了保护调节作用。因此，通过上述研究以及对胰腺损伤后细胞凋亡的情况分析，笔者推断HUC-MSCs可以通过调控不同的信号通路及相关因子的激活，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路等参与胰腺损伤发生后胰腺细胞凋亡的调控。

2.2血管生成 以往的研究表明，HUC-MSCs通过修复内皮功能障碍在发病过程中起着重要作用，从而影响新生血管[23]。而血管生成是一个多步骤的过程，涉及多个因子的参与，如血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)、血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)等。在所有这些信号中，VEGF-A信号传导被证明是激活胚胎血管生成和出生后血管生成的主要途径[24-25]。HUC-MSCs可以分泌多种促血管生成生长因子，如VEGF-A等，从而发挥增强血管生成和改善内皮细胞功能障碍的作用。研究表明，HUC-MSCs治疗不仅对炎症介质和胰腺组织病理学有明显效果，而且对胰腺血管生成表现出更多的作用[26-27]。HUC-MSCs产生的VEGF直接作用于内皮细胞与细胞的连接，并在维持内皮单分子层的完整性方面发挥了重要作用，从而导致了毛细血管泄漏和白细胞转移的减少。其次VEGF可以维持血管的完整性，提高内皮细胞的抗凋亡能力。Yang等[28]在诱导重症急性胰腺炎(SAP)后12h，通过大鼠尾静脉递送用或不用Ang-Ⅱ预处理的HUC-MSCs，阐明了用HUC-MSCs通过增强血管生成和改善VEGFR2依赖性内皮细胞功能障碍，改善了基于间充质干细胞对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的治疗结果。Wang等[29]比较了骨髓间充质干细胞和HUC-MSCs之间的基因表达情况，发现两者均能刺激血管生成，但血管生成相关因子在HUC-MSCs中被上调。此外，他们还在体外实验中验证两者均能促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和管形成，但HUC-MSCs更为明显。而且ERK和PI3K-Akt通路的激活可能是HUC-MSCs促进血管生成的机制。胰腺损伤后，部分胰腺组织坏死且不活跃,如果胰管厚破裂，大量胰液会溢出。胰液中的消化酶也能消化胰腺组织，导致更多胰腺组织和周围组织的坏死。加强血管形成、改善胰腺微循环有助于延缓创伤后坏死，促进胰腺组织的再生和修复。通过上述研究可知HUC-MSCs通过调控血管生成相关分子如FGF-1、VEGF-A和VEGFR-2的表达，促进体外和体内血管生成，抑制炎症，减少胰腺损伤促进损伤后胰腺血管生成。因此，笔者推测HUC-MSCs在促进血管生成中的作用可以为后续探索胰腺损伤组织的再生和修复提供新的方向。

2.3免疫调节 胰腺损伤后，巨噬细胞激活，而巨噬细胞的激活与胰腺损伤的严重程度相关。巨噬细胞可以诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等促炎性细胞因子的释放，且促炎细胞因子和氧化应激参与了后期并发症的发生[30]。最近的研究发现，HUC-MSCs含有多种免疫相关分子，包括溶酶体相关膜蛋白、MHC Ⅰ和MHC Ⅱ，可刺激T细胞极化为抗炎调节性T细胞(Treg)和巨噬细胞极化，抑制炎性CD4+T、CD8+T和自然杀伤(NK)细胞的增殖[31-32]。Jung等[33]2011年首次报道将骨髓间质干细胞移植到大鼠SAP的模型降低胰腺组织中炎症因子的表达，如TNF-α、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)等。后续也有相关研究证明：间质干细胞通过抑制血清和胰腺组织中促炎细胞因子的水平，增加抗炎因子的表达，并调节促炎和抗炎因子之间的平衡，具有抗炎特性。Ma等[34]研究了HUC-MSCs对胶原诱导关节炎(CIA)大鼠和类风湿关节炎(RA)患者T淋巴细胞的免疫调节作用，说明了HUC-MSCs抑制T淋巴细胞增殖，促进细胞凋亡，下调RORγt mRNA和蛋白表达，降低T辅助细胞17(Th17)细胞比例，上调人类重组蛋白(Foxp3)mRNA和蛋白表达，提高脾脏Treg细胞比例。此外，它们下调关节中的RORγt和Foxp3表达，抑制IL-17并促进血清中转化生长因子-β(TGF-β)的表达。胰腺损伤后，NF-κB被激活产生多种类型的细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-18。这些释放的细胞因子有助于产生初始信号，从而导致胰腺中中性粒细胞和淋巴细胞的浸润，加重炎症反应。HUC-MSCs可以通过参与相关促炎因子和抑炎因子的调控，从而减轻胰腺损伤后的炎症反应，有机会成为胰腺损伤后组织再生和修复的新选择。

2.4细胞增殖与迁移 在一定的病理条件下，损伤和坏死组织可通过邻近剩余健康细胞的增殖和迁移形成瘢痕组织[35-37]。脐带间充质干细胞内富含蛋白质、RNA和DNA。这些活性成分可以在细胞间稳定运输，参与细胞间的信息交换，并激活各种细胞类型的迁移和增殖[36,38-40]。有研究证明HUC-MSCs对原代人乳腺癌细胞和乳腺癌细胞膜修饰纳米囊泡(MDA-MB-231)和人乳腺癌细胞(MDA-MB)系呈现抑制作用，其潜在的机制可能与HUC-MSCs影响细胞周期停滞，诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制PI3K和AKT蛋白激酶的活性有关[36,41]。Liu等[42]证明HUC-MSCs可以通过Wnt/β-catenin与PI3K/Akt信号通路之间的串扰作用，从而抑制HCCC-9810人胆管癌细胞系的恶性表型。胰腺损伤后，胰腺实质发生节段性或弥漫性炎症，可导致胰腺坏死、纤维化、腺泡细胞和胰岛细胞萎缩和消失，导致胰腺结构损伤和胰腺内分泌和外分泌功能障碍。HUC-MSCs可以发挥刺激细胞增殖和诱导细胞活化从而发挥对损伤组织再生和修复的作用，可为治疗胰腺损伤后的组织再生和修复提供有益的尝试。

2.5旁分泌作用 HUC-MSCs通过旁分泌产生的外泌体可以再生细胞和组织，并显示出间充质干细胞作为治疗载体的潜力[43-44]。干细胞分泌的外泌体不仅含有特定的多能转录因子，而且含有丰富的非编码RNA，调节受体细胞中相关基因的表达，促进受体细胞的修复和再生[45-46]。其次，外泌体作为细胞间通讯的介质，通过调控凋亡基因，从而抑制受损细胞或组织的凋亡，促进组织修复和再生。但目前关于外泌体的研究，仅仅触及了参与外泌体介导的组织重塑和修复的复杂信号的表面，其具体的分子机制仍是未知数。其次，关于使用外泌体存在一些潜在问题，如安全性、剂量反应和不良反应[47-48]。因此，外泌体的研究仍处于起步阶段，未来临床应用前需要进一步的广泛研究。

3 HUC-MSCs在胰腺损伤动物模型的治疗应用(本课题组研究)

3.1基于损伤范围控制的大鼠胰腺损伤模型建立 模型建立采用中国人民解放军西部战区总医院自行研制的多功能动物撞击仪(图1)，该装置已获得国家发明专利(专利号：ZL 2016 1 0347341.9)。该生物撞击仪能够较好地模拟创伤发生条件，控制其损伤范围及严重程度，且具有便于携带、操作方便、成本低等优点。在400kPa的致伤压强下分别建立占胰腺总面积范围30%、60%的胰腺大范围挤压伤大鼠模型，在致伤机制上，相较于其他的小动物撞击仪，表现出的主要优势为胰腺血管损伤小、组织损伤重，从而使该创伤模型具有损伤范围可控、稳定性好等特点，能较好地模拟人体胰腺损伤后病理与生理变化[49-50]。

图1 撞击仪整体实物

3.2HUC-MSCs在大鼠胰腺损伤模型中的应用 史明等[51]选取已建模成功的SD大鼠，经尾静脉注射由活细胞染料标记的HUC-MSCs，分别于建模后6h，1、2、3、5、7d后(每个时间点5只)，经腹主动脉采血处死留取血液标本，检测血清淀粉酶、血清脂肪酶、炎症因子、氧化应激指标；留取胰腺组织检测凋亡指标(Bcl-2、Bax)；进行免疫组织化学染色，检测胰岛素促进因子-1(PDX-1)蛋白、巢蛋白、5-溴脱氧尿苷(BrdU)表达位置及表达量。留取肺组织，检测炎症指标(HMGB1、TNF-α和IL-1β)。结果表明：HUC-MSCs降低胰腺损伤后大鼠的血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、TNF-α的含量，除此之外，HUC-MSCs还可以有效减轻胰腺组织水肿、腺泡细胞坏死、炎症细胞的浸润。

4 问题与展望

胰腺损伤因其并发症多、病死率高，成为目前研究的焦点。但是关于胰腺损伤后促进组织修复及效应机制的研究仍较缺乏。前期笔者通过自主研制的多功能撞击仪建立了基于损伤范围控制的大鼠胰腺损伤模型，证实HUC-MSCs具有减轻胰腺组织损伤、促进胰腺外分泌功能恢复的作用。但HUC-MSCs存在滞留率低、细胞存活率低、无靶向发挥作用等问题，依然无法广泛应用于临床。此外，HUC-MSCs移植治疗胰腺损伤的具体分子机制尚未可知。因此，后续将针对HUC-MSCs存在的缺陷以及具体的分子机制开展深入研究，为胰腺损伤的治疗新方法提供实验和理论依据。

作者贡献声明：韩丽：论文撰写、文献检索整理；陈思平、周世波、史明、周黎晨、赵治戎、吉华：文献检索整理；戴睿武：论文指导、经费支持