滋阴补肾序贯法对肥胖型多囊卵巢综合征大鼠血清性腺相关激素及胰岛素抵抗指数的影响*

林 伟，梅阳阳，刘 轶，朱宏阳，魏 霖

(1.福建卫生职业技术学院护理学院，福建 福州 350101；2.福建卫生职业技术学院药学院；3.福建中医药大学附属第二人民医院病理科)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性常见的内分泌代谢紊乱性疾病，主要临床表现为高雄激素血症(HA)、高胰岛素血症(HI)及肥胖等，而肥胖体征在PCOS患者中占34.1% ～ 43.3%[1]，这不仅影响女性生育，还可增加糖尿病、心血管疾病及癌症的风险。PCOS具有病情周期长、难以治愈等特点，严重影响患者的身心健康。中医药治疗PCOS具有疗效高、改善代谢异常、不良反应小等特点[2]。滋阴补肾序贯法在临床治疗PCOS过程中，可有效改善其临床症状，但对肥胖型PCOS患者的治疗效果如何，报道甚少。因此，本研究建立肥胖型PCOS大鼠模型，通过滋阴补肾序贯法干预，观察大鼠血清性腺相关激素及胰岛素抵抗的变化，为临床患者用药指导提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及饲料 清洁级SD雌性大鼠56只，21日龄，体重(73.48±7.82)g，由福建闽侯润怡实验动物责任有限公司提供，许可证号：SCXK(闽)2016-0002。高糖高脂饲料，由福建卫生职业技术学院实验动物中心提供。

1.2主要仪器及设备 冷冻离心机(heal force公司，型号neofuge 13R)；酶标检测仪(Rayto公司，型号Rt2100c)；血糖仪及试纸(湖南三诺生物传感股份有限公司，型号GA-3型)。

1.3主要试剂及药品 脱氢表雄酮(DHEA，南京康满林生物医药科技有限公司，批号2017020)；注射大豆油(武汉拉那白医药化工有限公司，批号20180102)；链脲佐菌素(Streptozotocin， STZ，源叶生物有限公司，货号：18883-66-4)；ELISA试剂盒(上海润裕生物科技有限公司，睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素、胰岛素及总胆固醇货号分别为RY-EN30387、RY-EN30447、RY-EN34438、RY-EN30973、RY-E31082)；中药方剂中，滋阴方：女贞子、旱墨莲、熟地黄、山茱萸、白芍、菟丝子、当归；补肾方：川断、巴戟天、党参、淫羊藿、补骨脂；合方：即由滋阴和补肾方组成。上述药方由福建省人民医院提供。将上述药方混匀后，分别用冷水浸泡30 min，武火煎煮30 min，改文火煎煮30 min，过滤；重复煎煮第2次，将2次过滤汤药混匀，水浴浓缩至汤药浓度为含生药4.45 g/L，冷却后4 ℃保存。给药剂量按人鼠体重比剂量换算[3]。

1.4动物建模 21日龄SD大鼠适应性喂养3日，随机分为空白对照组(CN组，8只)和PCOS组48只。根据前期研究结果[4]建立PCOS大鼠模型，即PCOS组给予高糖高脂饮食，并且每只大鼠每日颈后背注射6 mg DHEA/100 g体质量+0.2 mL注射用大豆油，连续20 d，禁食12 h，予腹腔注射120 mg/kg STZ 柠檬酸钠溶液 0.1 mL/10 g 一次，继续高糖高脂饲料喂养14 d。同时阴道涂片观察各组大鼠动情周期变化，以确定PCOS模型是否创建成功。

1.5建模后分组及给药 PCOS组建模成功后，将其随机分为安慰剂组(AW=12只)和药物治疗组(滋阴组，ZY组=12只；补肾组，BS组=12只；序贯组，XG组=12只)，常规饲料喂养，并按照人鼠体重比计算每日每组灌胃给药剂量，即每日灌服5mL生药，连续20 d。其中AW组、ZY组和BS组则每日分别灌服生理盐水、滋阴方和补肾方汤药，连续20 d；XG组，先滋阴方灌胃2 d，后合方灌胃2 d，如此交替重复20 d。此外，应剔除因灌胃死亡例数(AW组，2只；XG组，2只)。

1.6血清性腺相关激素及胰岛素相关指标测定 干预结束后，于干预末日20:00开始禁食，次日晨8:00称体重，测空腹血糖(FBG)。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，抽取腹主动脉血2 mL。离心血液标本，提取血清，用ELISA法测定血清睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、空腹胰岛素(FINS)及总胆固醇(TC)浓度，按照试剂盒说明操作。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR= FBG×FINS/22.5，用来评估胰岛素抵抗情况。

2 结果

2.1动情周期变化 大鼠在动情前期，阴道涂片中有大量有核上皮细胞；在动情期，阴道涂片中可见大量无核角化上皮细胞；在动情后期，阴道涂片中可见大量白细胞浸润；在动情间期，阴道涂片中则可见少量角化上皮、白细胞和有核上皮细胞。通过观察大鼠阴道涂片的变化可以判断各组大鼠的动情周期。受试大鼠阴道涂片结果显示，CN组动情周期稳定(4～5 d)；48只PCOS组大鼠连续14 d阴道脱落上皮细胞呈角化状态，动情期延长，延长5～10 d。

2.2各组大鼠间体重和血总胆固醇水平的变化 AW组和药物治疗组大鼠体重均高于CN组(P<0.05)；AW组、ZY组和XG组大鼠血清TC高于CN组(P<0.05)；AW组和药物治疗组之间大鼠体重差异无统计学意义(P=0.488，0.870，0.742)；AW组和药物治疗组之间大鼠血清TC差异无统计学意义(P=0.070，0.549，0.747)。见表1。

2.3各组间大鼠血清性腺相关激素的变化 AW组血清T较CN组显著升高(P<0.01)，XG组血清T较AW组、ZY组和BS组显著降低(P<0.01)，ZY组和BS组较AW组有所降低，但差异无统计学意义(P=0.990，0.977)。各组间LH差异无统计学意义(P=0.572)。与CN组相比，AW组血清FSH显著降低(P<0.01)； XG组血清FSH较AW组和ZY组显著升高(P<0.01)，且比BS组高，但差异无统计学意义(P=0.948)。AW组LH/FSH值较CN组显著升高(P<0.01)，BS组和XG组LH/FSH值较AW组显著降低(P<0.01)，且XG组LH/FSH值较ZY组和BS组显著降低(P<0.01)。见表2。

表1 各组大鼠间体重和血TC比较

表2 各组大鼠间血清T、LH、FSH及LH/FSH水平比较

2.4各组间大鼠胰岛素抵抗指数的变化 各组间FBG差异无统计学意义(P=0.932)。AW组FINS较CN组显著升高(P<0.01)；ZY组、BS组和XG组FINS较AW组显著降低(P<0.01)，且XG组较ZY组和BS组显著降低(P<0.01)。AW组HOMA-IR较CN组显著升高(P<0.01)；ZY组、BS组和XG组HOMA-IR较AW组显著降低(P<0.01)；ZY组、BS组和XG组之间HOMA-IR差异无统计学意义(P=0.079，0.060)，但XG组比ZY组和BS组低。见表3。

表3 各组间大鼠胰岛素抵抗指标水平比较

3 讨论

PCOS病因及发病机制复杂，主要会导致育龄期女性无排卵性不孕。有研究[5-6]发现PCOS患者体内脂肪堆积、胰岛素抵抗与体内雄激素水平升高，导致卵泡发育异常，与形成卵巢多囊改变有关，且不管肥胖与否，PCOS患者均会出现不同程度的胰岛素抵抗[7]。中医认为肾虚是PCOS患病的根本[8]，并且通过滋阴补肾序贯法已在临床治疗PCOS取得一定的疗效，但对肥胖型PCOS患者的血清性腺相关激素及胰岛素代谢情况的变化如何，尚未完全清楚。

本研究通过给SD雌性大鼠注射DHEA创建PCOS大鼠模型，阴道涂片结果显示失去规律动情周期，且血清雄激素水平高于CN组，提示造模成功；同时持续高糖高脂饮食，结果显示PCOS组大鼠体重和TC、FINS高于CN组，提示PCOS组大鼠出现高胰岛素血症，且AW组HOMA-IR指数显著高CN组，提示存在胰岛素抵抗，可用于本实验及后续的研究。

有报道[9]显示44 %～77 % PCOS患者存在高胰岛素血症或胰岛素抵抗。高胰岛素血症可通过多种途径使黄体生成素增加，促进肾上腺和卵巢分泌雄激素，而高雄激素血症和高胰岛素血症又可抑制肝脏中性激素结合球蛋白合成而导致血液中睾酮升高，影响卵泡发育和抑制排卵[10]。但本研究结果显示各组间黄体生成素差异无统计学意义，AW组卵泡刺激素显著低于CN组，且AW组LH/FSH值显著高于CN组，这是否与卵巢局部过高雄激素而增强卵泡刺激素的芳香化酶活性，增加卵巢颗粒细胞中卵泡刺激素合成，从而抑制卵泡发育有关，其机制还有待进一步研究。

高胰岛素血症可增加患者的食欲，升高血脂水平。研究[11-13]发现PCOS患者中体重越高，发生胰岛素抵抗和高雄激素血症的概率越高，且高胰岛素血症可引起高雄激素血症，高雄激素血症亦可导致高胰岛素血症，形成恶性循环。本实验结果显示AW组大鼠体重和TC水平显著高于CN组； AW组FBG高于CN组，但差异无统计学意义；AW组FINS和HOMA-IR值显著高于CN组，这与冯兰青等[14]研究结果相似。Bergman等[15]研究发现胰岛素抵抗可影响糖原合成，使胰岛素清除率下降，进而出现肥胖，以及胰岛素抵抗类PCOS的高胰岛素血症。这是否由于胰岛素抵抗，使机体血糖水平维持正常水平，而使胰岛细胞分泌过高的胰岛素来降低血糖有关，进而出现高胰岛素血症，具体机制尚待进一步明确。

任青玲教授[16]在基于养心肾调整月经周期，运用滋阴补肾序贯法治疗胰岛素抵抗型PCOS患者取得一定的疗效。本研究滋阴补肾序贯法干预后， XG组FINS显著低于AW组、ZY组和BS组，且XG组FBG低于ZY组和BS组； XG组HOMA-IR指数均显著低于AW组，且XG组HOMA-IR指数低于ZY组和BS组，说明滋阴补肾序贯法可以降低血清高胰岛素水平，改善PCOS大鼠胰岛素抵抗情况。这与任青玲教授[16]的临床治疗效果一致。而且本研究结果也显示，XG组大鼠血清T显著低于AW组、ZY组和BS组，XG组大鼠血清FSH显著高于AW组、ZY组和BS组，XG组大鼠LH/FSH值显著低于AW组、ZY组和BS组，说明滋阴补肾序贯法可以有效降低PCOS大鼠血清睾酮、升高血清卵泡刺激素水平，调节黄体生成素和卵泡刺激素的比值，而降低血清雄激素。本研究结果说明滋阴补肾序贯法可以通过降低PCOS大鼠高胰岛素水平，改善胰岛素抵抗情况，而降低PCOS大鼠高雄激素血症，且XG组治疗优于ZY组和BS组，但是具体机制还有待进一步研究。

任青玲教授[16]运用滋阴补肾序贯法治疗临床PCOS患者后，患者体质量和体质指数明显下降。但是本研究结果显示，滋阴补肾序贯干预后，XG组PCOS大鼠的体重较AW组有所下降，但差异无统计学意义，且血清TC水平仍高于CN组。这说明通过单纯服药无法改善肥胖型PCOS大鼠体重和总胆固醇，在临床治疗中还需要结合饮食、体育锻炼和行为干预，以期达到最佳的治疗。

综上所述，滋阴补肾序贯法能有效降低肥胖型PCOS大鼠血清睾酮和空腹胰岛素水平、升高卵泡刺激素水平，使 LH/FSH水平降低，提示滋阴补肾序贯法可通过改善胰岛素抵抗和LH/FSH比值，而降低PCOS大鼠高雄激素水平，为临床用药指导提供实验依据。