牛冠状病毒流行病学和疫苗研究进展

苗 艳，朱庆贺，陈 亮，兰世捷，冯万宇，李 丹，张 蕾，沈思思，田秋丰，金振华，史同瑞*，李 白

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.呼玛县畜牧总站，黑龙江大兴安岭 165000)

牛冠状病毒(Bovine coronaviruses, BCoVs)是一种严重危害牛健康的病原，广泛存在于世界各地的牛群中，给养牛业造成巨大经济损失[1]。BCoVs可引起犊牛腹泻(Calf diarrhea, CD)和成牛冬季痢疾(Winter dysentery, WD)，以及幼牛上下呼吸道感染[2-3]，从腹泻犊牛的粪便样本和呼吸道样本中常分离到BCoVs[4-6]。BCoVs广泛分布于世界多个国家，在我国青海、新疆、辽宁、内蒙古、山东、广西、黑龙江等省份均检测出该病毒[7-9]。目前尚无治疗BCoVs感染的特效药物，疫苗接种和程序化防控是预防BCoVs感染的主要措施。掌握BCoVs的流行病学动态和疫苗研究状态可对诊断BCoVs和新型疫苗的研究提供科学依据。

1 病原学

1.1 BCoVs结构和分类 BCoVs属巢病毒目、冠状病毒科、正冠状病毒亚科、β冠状病毒属，与猪戊型肝炎病毒(HEV)、犬呼吸道冠状病毒(CoV)及人冠状病毒CoV-OC43 及HKU1同属于β冠状病毒属2a亚群成员[10]，是一种有囊膜的单股正链RNA(ssRNA)病毒，直径在65～210 nm之间，由一层短的血凝素和一层长的延伸至表面的刺突蛋白包裹。基因组大小在27～32 kb之间，编码5种主要结构蛋白，包括核衣壳蛋白(N蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和血凝素酯酶(HE)糖蛋白[11]。其中，核衣壳蛋白(N蛋白)在毒株中最为保守，常被用于进行病毒RNA检测[12]。S蛋白所包含的S1亚基上有主要的中和表位，S2亚基能够介导病毒融合蛋白，负责吸附靶细胞受体和进行膜融合。E蛋白参与病毒的装配。M蛋白包含能够被B细胞识别的表位。HE是一种能够破坏受体的酶(酯酶)，能进行反向血凝。HE蛋白和S蛋白都是重要的病毒蛋白，与病毒对宿主细胞的吸附和对鸡、小鼠、大鼠、仓鼠红细胞的凝集都相关，均能诱导产生中和抗体，从而阻止病毒的吸附和感染，对抗病毒免疫和疫苗的研制至关重要[1]。

1.2 BCoVs致病机制 动物通过粪口途径或气溶胶的吸入感染冠状病毒[1,13]。BCoVs通过S蛋白的S1蛋白部分结合到细胞膜受体(N-乙酰基-9-O-乙酰神经氨酸)从而侵入细胞。S蛋白的S2蛋白部分调节病毒与宿主细胞膜的融合[14]。病毒的最初复制发生在呼吸道(鼻腔、气管和肺)还是胃肠道(肠上皮细胞)目前尚且是一个有争论的问题。一种观点认为，最初的复制发生在呼吸道，大量的病毒被粘液保护然后被吞入从而去感染肠道[1,13];另一种观点认为，BCoVs最开始感染的是胃肠道，然后通过病毒血症到达呼吸道[15]。BCoVs在粪便和鼻分泌液中都有排放，病毒排放持续期较长，Kanno等2018年报道，他们通过巢式PCR对鼻腔和粪便中的病毒进行检测，分别最长在感染后的932 d和1058 d都检测到了病毒[16]。BCoVs传播的最常规路线是从母畜到犊牛或在犊牛间进行传播。畜群之间的传播，主要通过新动物的购进或通过被病毒污染的物品。犬已被当做一种牛冠状病毒的携带者[15]。BCoVs对整个胃肠道都有影响，从十二指肠开始直至大肠，导致肠绒毛萎缩和其他黏膜损伤。在呼吸道，其引起间质性肺炎、鼻甲、气管和肺上皮损伤[13,17-18]。

2 流行病学

BCoVs是引起3周龄以内奶牛和肉牛腹泻的主要病原之一，通过破坏肠绒毛，导致严重的、经常性肠道出血和腹泻。BCoVs感染引起的WD会造成奶牛产奶量的大幅度减少，从而造成巨大的经济损失[2]。WD主要发生在寒冷地区，但在一些热带国家也有报道，如泰国、巴西等[3,19]。BCoVs不仅存在于肠道中，还存在于肺脏中。根据临床症状将BCoVs分为两个群：从腹泻的小牛和成牛中分离到的BCoVs被称为牛肠道冠状病毒(Bovine enteric coronaviruses，BECoVs)，从有呼吸道临床症状的动物中分离到的冠状病毒被称为牛呼吸道冠状病毒(Bovine respiratory coronaviruses，BRCoVs)。BECoVs再细分为引起犊牛腹泻(CD)的BECoVs(BECoVs-CD)和引起成牛冬季痢疾(WD)的BECoVs(BECoVs-WD)[15]。牛冠状病毒病的临床表现不只与病毒本身的致病性相关，而且与宿主和环境因素相关，例如：动物自身的免疫状态、环境温度以及与其他病原的二次混合感染。

2.1 BECoVs流行病学 Mebus于1972年在内布拉斯加州大学偶然发现BCoVs后[20]，病毒很快被分离和鉴定[21]，随后被认为是一种可引起奶牛和肉牛腹泻的常见病原，主要通过患病牛的粪便进行传播。最易感年龄为出生后30 d内[15]，潜伏期为1～7 d，临床症状持续3～6 d[21-23]。在自然发生的牛腹泻疾病疫情中，BECoVs感染引起的腹泻在15%～70%之间，最早可以在剖宫产犊牛出生后24 h时，最晚至犊牛5月龄时检测到该病毒。被感染后的犊牛开始排放大量BCoVs，可持续排放两周，而恢复期的犊牛排毒量通常都较低[22]。在腹泻犊牛和健康犊牛粪便中均可检出BCoVs，但腹泻犊牛检测阳性率(8%～69%)要高于健康犊牛(0%～24%)[22]。尽管有血清BCoVs特异性抗体和肠道BCoVs特异性抗体存在，但仍在超过70%以上的健康牛样品中检测到低水平的BCoVs呈间歇性排放[22]。由于BCoVs在外界温度较低和紫外光强度较弱时更易存活，所以在冬季的几个月时间里，BCoVs排放率增加了50%～60%，这就可能导致成牛发生冬季痢疾[24-25]。在分娩时，BCoVs的排毒量也会增加65%，产后两周由于母牛免疫和激素紊乱会增加71%，因此，由于产后接触污染的会阴、乳头和产房，BCoVs阳性母牛所产犊牛的腹泻概率更高[24]。

2.2 BRCoVs流行病学 Thomas等于1982年首次鉴定了BCoVs为一种与犊牛肺炎相关的病毒[26]。随后，很多研究人员也证明，尽管在个体分离株之间血清型和抗原上有差异，但BECoVs和BRCoVs都是相同准种的成员[22]。BCoVs在所有年龄段的有呼吸疾病的牛上均被分离和检测到[1,27-28]。临床症状包括流鼻涕、呼吸困难、咳嗽、发烧和呼吸窘迫等[28]。Hasoksuz等的研究证明，BRCoVs的鼻腔和粪便排毒率分别为84%和96%[29]。Thomas等的研究证明，运达饲养场前三天的受试牛鼻腔排毒量始终高于粪便排毒量[30]。Gulliksen等对挪威的135个奶牛场进行了BCoVs的血清学调查，结果显示，BCoVs血清抗体阳性犊牛比阴性犊牛患呼吸疾病的危险性更高[31]。Lathrop等的研究证明，通过鼻腔排放BRCoVs的饲养场犊牛可能更易患呼吸系统疾病，且比不排放BRCoVs的动物肺部病变更严重[32]。鼻腔排放BRCoVs的犊牛比不排放的犊牛更易有呼吸道疾病[29-30]。

尽管已经通过流行病学调查和常规诊断得到了大量的佐证，但有关BCoVs诱导的呼吸道疾病和相关病理变化的证据仍不足。Ellis提出，仅通过在患病动物呼吸道样品中检测出BCoVs来判定BCoVs为诱导呼吸道疾病的病原是不足的，需进一步调查研究来证明病毒载体和临床症状之间的这种因果关系[33]。BCoVs是否可以直接作为一种呼吸道病原仍存争议。

2.3 我国BCoVs流行情况 BCoVs在我国多个省份和地区广泛流行。彭昊等对广西地区冠状病毒感染引起的牛腹泻病流行情况进行调查，结果显示BCoVs阳性率为17%[34]。崔鑫等对新疆12个规模化奶牛场的325份犊牛粪便样品进行BCoVs检测，结果显示，BCoVs阳性率为9.54%[35]。Abi Keha等在我国6个省14个养殖场共采集腹泻犊牛粪便190份，结果检测到36份BCoVs阳性样品，阳性率为18.95%[36]。何琪富等对青藏高原29个牦牛养殖场的336份腹泻样本进行BCoVs检测，结果有232份样品阳性，阳性率达69.05%[37]。杨海峰等对我国奶牛养殖量较大的14个省市的29个规模化牧场未断奶的犊牛进行呼吸道疾病综合征评估，结果显示，在176份样品中38份BCoVs阳性样品，阳性率为21.59%，其中采自黑龙江的病料中冠状病毒检出率达70%，新疆次之，同时对阳性病例与呼吸道疾病综合征临床症状的相关性分析结果表明，病畜的发热、鼻腔分泌物性状改变与BCoVs密切相关[7]。张坤等对新疆北疆地区规模化牛场犊牛腹泻冠状病毒病原进行调查，结果显示在检测的125份病料中BCoVs RT-PCR扩增阳性样品检测出65份，对N基因和S1的基因序列分析结果表明，新疆北疆地区的BCoVs与参考毒株的同源性较高，且亲缘关系具有地域性[38]。我国关于BCoVs的研究起步较晚，有关其流行病学调查的研究较少，但近年来BCoVs的流行又较为严重，因此需要对该病毒高度重视。

3 疫 苗

3.1 BECoVs疫苗 新生犊牛较易感染BCoVs，通常在产犊前给母牛进行疫苗接种，从而使母牛产生抗体，犊牛通过母牛初乳中的抗体获得被动免疫[39]。此外，犊牛可以在1日龄或稍微大一些日龄接种一种减毒活鼻内疫苗，可诱导一种能够迅速产生干扰素的先天免疫应答，这会使其快速产生免疫保护作用。流行病学研究表明，中和抗体和红细胞凝集抗体水平与所产生的保护作用相关[1]。鼻内疫苗通常在3～4日龄通过注射器一次性接种，也可当犊牛大些进入饲育场时接种鼻内疫苗。灭活疫苗也在怀孕牛上被使用。目前市面上有两类可用于预防BCoVs引起的新生犊牛肠道疾病的疫苗。一类是灭活疫苗，包括美国辉瑞动物保健公司的Scour Guard 3(K)、美国先灵葆雅动物保健的Guardian、瑞氏诺华动物保健的Scour-Bos，这三种疫苗通过对怀孕晚期的母牛进行接种以使所产犊牛获得被动免疫。目前认为，通过初乳被动免疫是犊牛接种BCoVs的可靠模式。只有在出生后24 h内获得免疫孕牛产生的高水平的初乳IgG1才能保护新生犊牛免受BCoVs感染，而24 h后免疫的犊牛可能得不到保护。另一类是改良的活疫苗，包括美国默克公司的Bovilis和Guardian、美国辉瑞动物保健公司的Calf-Guard、ScourGuard 4KC和 BoviShield Gold 5、日本京都KyotoBiken实验室的 CattleWin BC，这三种疫苗通过口服给新生犊牛以提供主动免疫。然而，在奥地利进行的一项实地研究中，这种免疫接种的效力受到质疑[15]。除了注射时间和疫苗免疫效果，还需考虑的是接种疫苗后对所选择接种部位的影响。在早期的一项研究中发现，用减毒的呼吸道毒株疫苗给牛进行肌肉注射是安全的[40]。但在另一项研究中，用灭活的BCoVs和细菌成分的疫苗给牛进行肌肉注射接种，结果显示大约有50%的牛跛行并发展为肌炎[41]。

3.2 BRCoVs疫苗 现代疫苗接种计划中使用多价灭活疫苗、改良的活病毒疫苗和减毒细菌抗原来降低牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的发病率和流行率，但没有一种用于预防BRCoVs的商品化的疫苗，且对BRCoVs的免疫保护研究也较少。Plummer等使用改良的冠状病毒和轮状病毒活疫苗鼻内接种犊牛，显著降低了到达饲养场时有较低滴度BCoVs血清抗体的犊牛随后的呼吸道疾病风险，无论是单独使用还是与牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1，BHV-1)联合使用，在降低饲养场牛BRDC发病率和后续治疗方面可能具有协同效应或产生其他效应[42]。BCoVs抗体滴度可能与对呼吸道感染的保护作用相关，并可能减少病毒在鼻腔分泌物中的排放[43]。Hasoksuz等的研究结果显示，BCoVs抗体滴度大于1600的牛的粪便或鼻腔不会排放BCoVs[29]。Thomas等建议，饲养场犊牛至少应在运输前3周接种BCoVs疫苗，以诱导产生血清IgG滴度达1860以上，从而对BCoVs感染及其与BRDC有关的其他病原体混合感染产生保护作用[30]。

未来的疫苗研究方向是开发出一种能够预防不同BCoVs野毒株的疫苗，以预防不同临床症状的BCoVs感染。研究一种包含CD、WD和呼吸道分离株的多毒株混合疫苗可能是开发广谱BCoVs疫苗的理想策略，这种疫苗可能有效预防各种BCoVs感染。

4 小结与展望

不同的冠状病毒可以感染多种家畜，包括狗、猫、牛、猪和家禽等，而其中多数都能通过常规疫苗接种进行控制。BCoVs疫苗已被广泛用于预防BCoVs感染，它能够保护犊牛免于由BCoVs感染引起的肠道和呼吸道疾病。但目前的疫苗也存在一些缺点，如保护性免疫的持续期相对较短，缺少有效的灭活苗等，还需要进一步研究以预防该病和限制其传播。目前有关该病毒的遗传信息仍然有限。BECoVs和BRCoVs尚未明确区分，它们确实在很大程度上发生交叉反应。BCoVs和BRDC之间的因果关系尚未明确，这是在疾病预防或预处理计划中必须考虑的问题。

未来的研究领域包括了解BECoVs和BRCoVs的发病机制，BCoVs和BRDC的因果关系，BCoVs与宿主和环境因素之间的相互作用关系，BCoVs的种间传播宿主范围和调控机制等。