牙鲆黏膜IgM与多聚免疫球蛋白受体同源分子的应答动态研究❋

绳秀珍， 宋满满， 朱 慧， 唐小千， 邢 婧， 迟 恒， 战文斌

(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)， 山东 青岛 266003)

鱼类生活的水环境中富含病原微生物，其黏膜免疫系统在免疫防御中起到至关重要的作用[1-2]。鱼类的黏膜相关淋巴组织主要包括皮肤、鳃、肠及鼻咽等[3-4]，共同特点是在黏膜表面的黏液中含有分泌型免疫球蛋白(SIgs)及其他免疫分子，构成抵御病原入侵的第一道屏障。哺乳动物中研究发现，黏膜固有层中的浆细胞产生的多聚免疫球蛋白(pIgA或pIgM)通过多聚免疫球蛋白受体(pIgR)介导的转胞吞作用跨上皮转运至黏膜表面形成SIgs，发挥清除病原体及毒素的黏膜免疫防御作用[5-6]。对鱼类研究发现，pIgR可以结合牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鲤(Cyprinuscarpio)、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)等鱼类的四聚体免疫球蛋白M(IgM)[7-9]以及虹鳟 (Oncorhynchusmykiss)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)、大西洋鲑(Salmosalar)等鱼类的二聚体IgT[10-11]；牙鲆pIgR可以介导IgM-抗原复合物跨上皮转运至肠黏液中[12]；灭活鳗弧菌(Vibrioanguillarum)免疫牙鲆后，皮肤、鳃、肠黏液及胆汁中pIgR及IgM水平升高，并检测到pIgR-IgM复合物[13]，表明鱼类pIgR可介导黏膜IgM的分泌及免疫复合物的清除。

最近，在大西洋鲑(Salmosalar)、斑马鱼(Daniorerio)、鲤和牙鲆等鱼类中发现了pIgR同源分子(pIgR-like，pIgRL)，与鱼类pIgR一样含有两个免疫球蛋白样结构域(ILDs)，推测其可能具有类似pIgR的功能[14-17]。研究发现，大西洋鲑pIgRL在鱼的皮肤和鳃中均有较高水平表达，但在皮肤中转录水平低于pIgR[14]。斑马鱼的免疫组织中可检测到pIgR和pIgRL转录，但在淋巴细胞和骨髓细胞中只检测到pIgRL转录，且转录水平在海豚链球菌(Streptococcusiniae)感染后显著提高，但在弹状病毒感染后则降低[15]。牙鲆黏膜组织中pIgRL与IgM的表达在灭活鳗弧菌免疫后显著上调，在黏液中检测到pIgRL-IgM复合物[17]。这些资料说明pIgRL也在鱼体免疫防御中发挥着重要作用，但是对于pIgRL介导的黏膜抗体分泌机制尚不明晰，还有待深入研究。

作者前期克隆表达了牙鲆pIgRL，制备了其特异性抗体，在基因水平上研究了灭活鳗弧菌诱导pIgRL与IgM的应答变化，确认鳃、皮肤和肠黏液中存在pIgRL-IgM复合物[17]。在此基础上，本文利用灭活鳗弧菌免疫牙鲆，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定了鳃黏液、皮肤黏液、肠黏液和胆汁中pIgRL与IgM蛋白水平的时序变化，使用多重荧光标记技术对不同时间点的肠组织中IgM和pIgRL进行共定位染色，利用ImageJ软件进行共定位定量分析，以寻找牙鲆pIgRL跨上皮转运IgM的证据，本研究可为深入理解pIgRL的黏膜免疫功能提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物及抗体

240尾健康牙鲆购自山东省日照市某养殖场，体长为15～20 cm。牙鲆饲养在实验室水族箱中，海水温度21 ℃左右,溶氧量为6.0 mg/L，每天喂食2次商品化饲料，暂养驯化2周后进行免疫实验。

鼠抗牙鲆血清IgM单克隆抗体2D8[18]、兔抗牙鲆pIgRL多克隆抗体[17]由本实验室制备并保存。

1.2 牙鲆免疫及样品采集

将实验室保存的鳗弧菌[19]从-80 ℃冰箱中取出，解冻后接种到1 mL的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，次日转至500 mL的LB培养液中继续培养24 h。鳗弧菌于8 000g离心10 min后，使用磷酸缓冲液(PBS，pH=7.2)重悬。采用前期的方法制备鳗弧菌灭活疫苗并进行安全性检测[13]。然后，将灭活疫苗用PBS洗涤3次，调整浓度至1×1010CFU/mL，保存于4 ℃冰箱备用。

将暂养的健康牙鲆随机分为4组，每组60尾。浸泡免疫组在海水中加鳗弧菌灭活疫苗至最终浓度为1×108CFU/mL，将牙鲆浸泡30 min后，移至新鲜海水中；对照组1在海水中加入等量PBS，同样浸泡处理。注射免疫组牙鲆每尾腹腔注射1×108CFU/mL鳗弧菌疫苗100 μL，对照组2注射等量PBS。分别于免疫前(0 d)以及免疫后1、3、5、7、10、14、21、28、35和42 d从各组中随机选取5尾牙鲆，按照上述方法收集皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁[13]。将黏液和胆汁于12 000g下离心15 min，保存于-80 ℃冰箱备用。

分别于0、3、7、14、21和28 d随机取3尾浸泡免疫组牙鲆，解剖取后肠组织，无菌PBS冲洗干净，OCT包埋，于-80 ℃冰箱速冻4 h以上。

1.3 ELISA法检测pIgRL与特异性IgM蛋白水平变化

1.3.1 pIgRL蛋白水平测定 将各时间点的皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁各100 μL加至96孔酶标板中，每个样品3个重复，4 ℃包被过夜。次日用含0.05%吐温(Tween-20)的PBS(PBST)洗涤3次，每次5 min。每孔加入5% 牛血清白蛋白(BSA) 100 μL，37 ℃下孵育1 h。洗涤3次后，每孔加入兔抗牙鲆pIgRL多抗100 μL(1∶1 000，PBS稀释)，以健康兔血清作为阴性对照，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤，每孔加入100 μL碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体(1∶5 000)，37 ℃下孵育1 h，再加入100 μL含0.1% 3-(4-硝基苯基)丙炔酸甲酯(pNPP)的发色液避光反应10 min，用2 mol/L NaOH中止发色，在405 nm条件下测定平均吸光度值(OD)。

1.3.2 特异性IgM蛋白水平测定 将灭活鳗弧菌的蛋白浓度稀释为0.1 mg/mL，每孔100 μL加于96孔酶标板中，4 ℃包被过夜。次日PBST洗涤3次，5% BSA 37 ℃封闭1 h。PBST洗涤3次后，分别加入100 μL皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤后，加入鼠抗牙鲆血清IgM单抗2D8(1∶1 000)作为第一抗体，健康鼠血清作为对照，37 ℃孵育1 h；然后加入100 μL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶5 000)作为第二抗体，37 ℃孵育1 h。上述同样方法发色，测定平均吸光度值(OD)。

1.4 多重荧光标记及激光扫描共聚焦显微镜观察

制作厚度为7 μm的冰冻切片，使用4 ℃预冷的丙酮固定10 min，通风橱中晾干。PBS洗涤10～15 min，甩片机甩干。5% BSA封闭切片1 h(37 ℃)，PBST洗涤3次，每次5 min。鼠抗牙鲆IgM单抗2D8与兔抗牙鲆pIgRL多抗的混合液作为一抗，37 ℃孵育1.5 h，鼠阴性血清和兔阴性血清的混合液代替一抗作为阴性对照。PBST洗涤后，Alexa 488标记羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 649标记羊抗兔IgG的混合液作为二抗，37 ℃下避光孵育1 h。PBST洗去多余抗体，室温下用DAPI(1∶1 000)染细胞核10 min。60%甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察拍照，并应用ImageJ软件定量分析IgM与pIgRL在肠黏膜组织中的共定位情况[13]。

1.5 数据统计分析

所得数据使用SPSS 20 软件通过单因素方差检验分析差异的显著性，使用Origin 8.0 作图，P<0.05时为差异显著。

2 结果

2.1 牙鲆黏液和胆汁中特异性IgM免疫应答水平变化

腹腔注射和浸泡灭活鳗弧菌后，ELISA法检测不同时间点牙鲆黏液及胆汁中特异性IgM水平变化，发现IgM水平在42 d内呈先升高后降低的变化趋势(见图1)。浸泡免疫后，特异性IgM在皮肤黏液和鳃黏液中分别于第7和10天达到峰值(见图1A、1B)，在肠黏液和胆汁中于第21天达到峰值(见图1C、1D)。经腹腔注射免疫后，IgM在皮肤黏液和鳃黏液中均于第14天达到峰值(见图1A、1B)，在肠道黏液和胆汁中于第21天达到峰值(见图1C、1D)。两组牙鲆肠黏液IgM峰值最高。注射组牙鲆皮肤黏液、肠黏液及胆汁中IgM峰值较浸泡组稍高(见图1A、1C、1D)，而浸泡组牙鲆的鳃黏液IgM较注射组稍高(见图1B)。

图1 灭活鳗弧菌注射和浸泡免疫后牙鲆特异性IgM蛋白水平变化

2.2 牙鲆黏液和胆汁中pIgRL蛋白水平的动态变化

经浸泡和注射免疫灭活鳗弧菌后，牙鲆皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁中pIgRL蛋白水平与IgM呈相似的变化趋势，但比IgM应答要早(见图2)。经浸泡免疫后，pIgRL蛋白水平在皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁中分别于第5、3、7和10天达到峰值(见图2A—D)；其中皮肤黏液中pIgRL水平最高，鳃和肠黏液次之，胆汁最少。注射免疫后，上述分泌液中pIgRL水平分别于第7、5、10和10天达到峰值(见图2A—D)。注射组牙鲆鳃黏液、肠黏液及胆汁中pIgRL峰值较浸泡组高(见图2B、2C、2D)，而皮肤黏液中pIgRL的峰值较浸泡组稍低(见图2A)。

2.3 牙鲆肠黏膜组织中IgM与pIgRL的动态分布及共定位分析

牙鲆肠道由黏膜层、黏膜下层、肌肉层和浆膜组成；黏膜层呈现高低不等的褶皱，由上皮层和固有层组成；褶皱固有层与黏膜下层之间缺乏黏膜肌层。肠黏膜组织中IgM和pIgRL双重荧光染色结果如图3所示。免疫前，IgM阳性绿色荧光主要位于肠黏膜固有层，少量位于上皮细胞基底部；而pIgRL阳性红色荧光少量位于固有层，较多存在于黏膜下层，但在肠上皮细胞层未观察到阳性信号(见图3A、3A’)。浸泡免疫灭活鳗弧菌后，3和7 d时，肠黏膜固有层及上皮细胞基底侧的IgM绿色阳性信号逐渐增强；固有层中pIgRL红色信号也明显增强，3 d时在上皮细胞层开始出现少量阳性信号，7 d时明显增强(见图3B、3B’和3C、3C’)。14和21 d时，肠上皮细胞层IgM阳性信号大量累积，固有层中pIgRL信号增强，观察到代表IgM和pIgRL共定位的橙黄色荧光信号(见图3D、3D’和3E、3E’)。28 d时肠上皮细胞内IgM阳性信号开始减少，但固有层中仍有较强的pIgRL红色信号及二者共定位的橙黄色信号，且比上皮层更明显(见图3F、3F’)。

采用ImageJ软件定量分析图3A—F中IgM与pIgRL的共域化程度，分别使用绿色和红色代表pIgRL和IgM阳性信号生成新的合并图像(见图4，a1—f1)。在黏膜层任选相同大小的矩形区域，构建其3D模型图，两种阳性信号重合的像素点表示为蓝色，代表IgM和pIgRL 共定位(见图4，a2—f2)。通过ImageJ软件对图像进行荧光校正以去除背景色可能产生的误差，通过为每个通道自动设置阈值来消除背景颜色和噪音，绘制光密度图，横坐标上的重叠像素为IgM与pIgRL的共定位区域(见图4，a3—f3)，具体的百分比值以饼状图来表示(见图4，a4—f4)。结果表明，所选矩形区域共包含150个像素点，免疫前(0 d)，IgM与pIgRL重叠像素占比19%，而 IgM和pIgRL单阳性信号占比分别为17%和24%，没有荧光信号的区域占比40%；免疫后3 d时，二者共定位的百分比为25%，7 d时为41%，14 d时为 35%，21和28 d时为28%(见图4，a4—f4)，表明肠黏膜层存在二者共定位，即存在IgM-pIgRL复合物的跨上皮转运。

(图A—F分别为免疫前(0 d)及免疫后3、5、7、14、21和28 d的图像定量分析。图a1—f1是图3 A—F新生成的合并图像，绿色和红色分别表示 pIgRL和IgM阳性信号;图a2—f2分别为图a1—f1中所选矩形区域的3D模型图；图a3—f3为选定区域内两种荧光的光密度图，分析IgM和pIgRL的共定位；图a4—f4为IgM和pIgRL共定位百分比的饼状图。Fig.A—F: Quantitative image analysis at 0, 3, 5, 7, 14, 21 and 28 d respectively. Fig.a1—f1： A new merged image of Figures 3A—F using green and red to represent pIgRL and IgM positive signals, respectively; Fig.a2—f2: The interactive 3D surface plot of the selected rectangular area in Fig.a1—f1. Fig.a3—f3: Analysis of co-localization of IgM and pIgRL according to the optical density of the positive fluorescence in the selected area. Fig.a4—f4: A pie chart to show the percentage of IgM and pIgRL co-localization.)

3 讨论

鱼类的皮肤、鳃、消化道等黏膜组织是病原感染鱼体时最先接触的部位，其黏膜上皮屏障相比于陆生动物面临更大的威胁，黏膜组织及其表面的黏液是鱼类抵御外界病原入侵的第一道防线，而其局部的特异性免疫应答对抵御病原体至关重要[3-4, 20]。pIgR介导SIgs的跨上皮分泌、抗原清除及中和病原体等功能在鱼类的免疫防御及免疫稳态中发挥着重要作用[21-22]。pIgRL作为pIgR的同源分子，已在大西洋鲑、斑马鱼、鲤、牙鲆等鱼类中克隆表达[14-17]，但目前对其在黏膜免疫防御中的功能还知之甚少。我们前期研究发现使用鳗弧菌灭活疫苗浸泡免疫牙鲆可诱导pIgRL基因在鳃、皮肤、脾和后肠中高表达，而注射免疫诱导pIgRL基因在脾、头肾、皮肤和鳃中高表达，并在肠黏液、皮肤黏液和鳃黏液中检测到pIgRL-IgM复合物[17]，表现出与牙鲆pIgR相似的响应特征[13]，但其是否具有介导黏膜IgM分泌的功能尚未可知。本文在此基础上，利用实验室前期制备的牙鲆pIgRL[17]及IgM特异性抗体[18]，研究灭活鳗弧菌免疫牙鲆后pIgRL和IgM在皮肤黏液、鳃黏液和肠黏液以及胆汁中的应答变化，检测了二者在肠黏膜上皮层的共定位情况，并利用ImageJ软件进行了定量分析确定存在二者共定位，证明牙鲆pIgRL可能具有类似pIgR介导IgM跨上皮转运的功能，pIgRL参与牙鲆的黏膜免疫防御。

疫苗接种是预防鱼类疾病的有效措施，注射和浸泡免疫是常用的接种方式[23]。本文利用灭活鳗弧菌经腹腔注射和浸泡两种方式免疫牙鲆后，发现黏液(皮肤、鳃和肠)和胆汁中pIgRL和IgM蛋白水平均呈先升高后降低的趋势；在皮肤、鳃和肠的黏液中pIgRL表达水平在浸泡免疫后的峰值时间(5、3和7 d)早于注射免疫后的峰值时间(7、5和10 d)，浸泡免疫诱导pIgRL蛋白水平变化与基因水平变化的结果一致[17]，表明浸泡免疫途径能够更早地刺激黏膜免疫应答。对于黏膜IgM的响应，浸泡组在牙鲆皮肤黏液、鳃黏液和肠黏液及胆汁中IgM分别于7、10、21和21 d达到峰值，与我们前期研究的结果一致[13]；注射组IgM在皮肤黏液和鳃黏液中于14 d达到峰值，在肠黏液和胆汁中于21 d达到峰值；皮肤黏液和鳃黏液中浸泡组IgM水平比注射组达到峰值点的时间早，说明浸泡免疫使得灭活疫苗直接接触牙鲆皮肤和鳃，诱发了鱼体的局部免疫应答。但是注射组皮肤黏液和鳃黏液中IgM的峰值时间(14 d)与前期结果(21 d)有差异[13]，可能是因为实验鱼不是同一批次或黏液取样操作差异所致。本文及前期结果[13]皆显示，无论是浸泡还是注射免疫方式，pIgRL及pIgR的应答皆早于IgM，这一结果与基因水平的变化具有相似特征[13, 17]，这表明牙鲆pIgRL和pIgR在免疫初期比IgM更早起作用，黏膜上皮更早表达pIgRL及pIgR可以为IgM的跨上皮转运做准备。

目前肝脏和胆汁在鱼类免疫防御中起到的作用还不是很明确。Abelli[24]发现在北极硬骨鱼(Trematomusbernacchii)的胆汁中存在Ig，肝门管区含有浆细胞，Abelli认为Ig可能通过肝细胞运输进入胆汁，然后释放进入肠道保护肠黏膜上皮，因此，可能与哺乳动物一样,鱼类的肝脏是黏膜Ig的分泌位置[23]，但尚缺乏肝胆运输的直接证据。我们前期曾在牙鲆胆汁中检测到灭活鳗弧菌诱导的IgM和pIgR上调表达以及IgM-pIgR复合物，表明肝脏也参与黏膜免疫[13]。本文在牙鲆胆汁中检测到特异性IgM和pIgRL的存在，表明pIgRL可能也参与了胆汁IgM的分泌，但是，关于鱼类pIgRL及pIgR如何参与胆汁IgM的分泌还有待进一步研究。

关于鱼类pIgRL组织分布的研究较少。斑马鱼免疫组织、淋巴细胞和骨髓细胞中可检测到pIgRL转录[15]。鲤鱼pIgRL表达于巨噬细胞[16]。本研究中，免疫前pIgRL阳性信号主要出现在牙鲆肠黏膜固有层中，这与我们前期发现牙鲆pIgR主要表达于皮肤、鳃、肠及肝小管的上皮细胞有较大差异[12]，这暗示牙鲆pIgRL在黏膜免疫中的作用可能与pIgR存在差异。浸泡免疫后，IgM阳性信号在牙鲆肠黏膜固有层中逐渐增多，随后在肠上皮细胞层中增强，肠腔中也逐渐出现阳性信号，显示出从固有层向肠上皮细胞层、继而向肠腔内移动的趋势。而免疫后pIgRL阳性信号在肠上皮层少量出现，固有层中观察到较多代表IgM和pIgRL共定位的橙黄色荧光信号，ImageJ软件定量分析发现，免疫前(0 d)二者共定位的百分比为19%，免疫后3、7、14和21 d时分别为25%、41%、 35%和28%，前期研究发现牙鲆皮肤黏液、鳃黏液和肠黏液中存在pIgRL-IgM复合物[16]，以上结果表明pIgRL和IgM以复合物的形式跨上皮转运，最后分泌至肠黏液中，这与肠黏液中IgM 及pIgRL水平随时间延长而增高的结果相匹配。因此，牙鲆可能存在pIgRL介导的IgM跨上皮转运机制，但pIgRL是否参与IgM的转胞吞作用及pIgRL与pIgR功能的差异还有待进一步研究。

目前在鱼类中仅发现IgM、IgD和IgT三种免疫球蛋白。对虹鳟的研究发现，pIgR可与鳃和皮肤黏液中IgT、IgM和IgD结合，鳃和皮肤的上皮细胞呈现pIgR和IgT阳性，表明虹鳟pIgR可能在IgM、IgT和IgD转运过程中起重要作用[25-26]，但对黏膜抗体的转胞吞作用过程还有待深入研究。由于本实验室缺乏牙鲆IgT的特异性抗体，本文仅研究了牙鲆pIgRL及IgM对疫苗免疫的响应特征，对于牙鲆pIgRL与IgT、IgD之间的关系还有待后续研究。