保山猪LPL 基因表达量与生长及胴体性能的关联分析

李文君，程 娜，龚绍荣，赵加鼎，邱丙姗，吴正明，李再磊，周戚斌，赵桂英*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南省保山市保山猪研究所，云南保山 678200）

生产性能测定在养猪生产实践过程中具有重要意义，是选育优良猪种的基础，是组织生产的依据，也是衡量养猪生产水平的标准。猪的生产性能一般包括生长性能、胴体性能、繁殖性能等，其中胴体性能又包括背膘厚度、瘦肉率、脂比率、眼肌面积等。当今养猪业重视猪生长速度和瘦肉率的提高，却忽视了胴体品质的改善，而改善猪胴体品质的难点和关键点是在较低背膘厚和皮下脂肪含量的前提下，同时提高瘦肉率及肌内脂肪的含量。

脂蛋白脂肪酶（Lipoproteinlipase，）是参与合成和分解脂肪的关键酶，是脂肪、心肌、骨骼肌和乳腺细胞等实质细胞合成和分泌的一种糖蛋白，是对动物脂肪沉积具有调控作用的重要基因。已有研究发现：基因具有调控脂类代谢的功能，其多态性与动物的生长性能和胴体品质关系密切；基因在不同组织中的表达存在组织特异性，在一定程度上影响肌内脂肪含量（IMF），且在背肌及肌内脂肪中表达量越高，肉品质相对较好；基因可以通过调控脂肪组织和肌肉组织发育过程中所需营养物质的水平，进而影响眼肌面积、瘦肉率和脂比率等胴体性状。

保山猪又名保山大耳朵猪，原产于云南省保山市，毛色大多为黑色，少数为棕色，体长皮厚，耳肥大而下垂，具有适应性强、耐粗饲、对青绿饲料利用能力较好、饲料的利用转化率相对较高等优良特性；其肉质鲜美细嫩、香味浓郁、营养物质含量丰富，是制作腊肉和火腿的优质原材料。目前在其他猪种上已有基因表达量对生产性能影响的相关研究，但对保山猪生产性能的影响还需进行更深层次的探究。因此，本实验以保山猪为研究对象，探究基因表达量与生长性能、胴体性能之间的关联性，对保山猪的选育、培育新品种、提高养猪效益具有重要的指导意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物及采样 从保山市保山猪研究所随机选取10 头断奶后的纯种保山猪，在相同饲养条件下饲养，达260 日龄后随机宰杀6 头（3 ♂，3 ♀），取适量的肝脏、背最长肌和背脂样品，放入无RNA 酶的冻存管中，用液氮罐运回实验室，转存于超低温冰箱（-80℃）中备用。

1.2 实验方法

1.2.1 测定指标 生长性能中的平均日增重、耗料增重比指标参照《NY/T 822-2004 种猪生产性能测定规程》测定，胴体性能中的屠宰率、宰前活重、三点背膘厚、皮厚、皮比率、瘦肉率、脂比率、眼肌面积、骨比率等指标参照《DB43/T356-2007 猪性能测定技术规范》测定。

1.2.2 总RNA 的提取及检测 保山猪肝脏、背脂及背最长肌的总RNA 采用北京擎科生物科技有限公司的动物组织或细胞总RNA 提取试剂盒（TSP413）提取。用凝胶电泳法及核酸浓度检测仪测定每个样品的RNA 浓度以及OD值，判断RNA 的完整性、浓度及纯度是否符合后续实验要求。

1.2.3 反转为cDNA 将质检合格的RNA 样品，用北京擎科生物科技有限公司TSK302S 逆转录试剂盒（GoldenstarRT6cDNASynthesisKitVer.2）提供的方法，反转为cDNA。

1.2.4 实时荧光定量PCR 参照NCBI 收录的基因序列：内参基因（登录号：NM_205518.1），目的基因（登录号：NM_214286.1），用在线软件Primer 3.0进行引物设计并找出最佳的引物设计方案，送北京擎科生物科技有限公司合成。引物设计如下：内参基因：上游引物（F）:5'-ACAGGTGCAGAAGTGGGATG-3'，下游引物（R）：5'-TGGTAGCCGTGACACCTTTC-3'，退火温度：58℃；基因：上游引物（F）：5'-CCCTG GCTTTGCTATTGAGA-3'，下游引物（R）：5'-GAGACTT GTCGTGGCATTTC-3',退火温度：60℃。

参照北京擎科生物科技有限公司2×TsingKeMasterqPCRMixSYBRGreenI 试剂盒提供的方法进行RT-qPCR。在超净工作台中避光配制反应体系：2×TsingKeMasterqPCRMix10 μL、上下游引物（10 μmmol/L）各0.8 μL、模板DNA（<100 ng）：2 μL、ddHO：6.4 μL；反应条件：基因：95 ℃预变性1 min，95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，循环40 次；基因：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸10 s，循环40 次。

1.2.5 数据的统计与分析 保山猪的生长、胴体性能数据用Excel 表格整理，使用SPSS 23 软件完成数据差异显著性检验，并通过分析数据判断基因相对表达量与保山猪生长、胴体性能是否有关联。实验数据以“平均数± 标准误（¯±SE）”表示。本实验中，内参基因是（-actin），把目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数作为Ct 值，∆Ct=Ct-Ct，目的基因的相对表达量用2值计算。

2 结果与分析

2.1 生长性能、胴体性能测定 对保山猪的生长性能及胴体性能进行测定，测定结果如表1 所示，生长性能中保山猪的平均日增重为323.46 g/d，耗料增重比为4.89；胴体性能中保山猪的3 点背膘厚为4.699 cm，眼肌面积为25.459 cm，瘦肉比率为34.30%，皮比率为12.36%，脂比率为44.12%。

表1 保山猪的生长性能及胴体性能测定结果

2.2 总RNA 的提取及质检 观察提取的总RNA 凝胶电泳图（图1），发现只有2 个条带（18S 和28S）明亮且清晰，5S 条带不太清晰，说明RNA 提取成功。总RNA 检测结果如表2 所示，OD值最大不超过2.2，最小不低于1.8，且浓度均高于100 ng/μL，表明总RNA质量检测结果均达到要求，可进行后续反转实验。

表2 样品总RNA 质量检测

图1 部分保山猪3 个组织总RNA 琼脂糖凝胶电泳图

2.3基因的相对表达量 对基因进行荧光定量PCR 测定，其相对表达量结果如表3 所示，基因在保山猪3 个组织中的相对表达量从高到低依次为：背脂、背最长肌、肝脏；基因在背脂与背最长肌和肝脏中的相对表达量差异极显著，在背最长肌与肝脏中的相对表达量差异不显著。基因在保山猪3 个组织中的表达水平为：背脂>背最长肌>肝脏（图2）。

表3 3 个组织中LPL 基因的相对表达量

图2 LPL 基因在保山猪肝脏、背最长肌和背脂中的表达水平

2.4基因在3 个组织中的相对表达量与生长和胴体性能的关联分析 由表4 可知，基因在保山猪背最长肌中的表达量与皮比率呈极显著负相关；在背脂中的表达量与脂比率呈显著正相关，与眼肌面积呈显著负相关。

表4 LPL 基因在保山猪3 个组织中的表达量与生长及胴体性能的关联分析

3 讨 论

赵桂英等研究发现，高黎贡山猪的日增重在200 g左右、耗料增重比最高可达5。连林生的研究表明，约杜保三元杂交猪育肥期的日增重为814 g、耗料增重比为3.09，本实验中，保山猪的日增重为323.46 g、耗料增重比为4.89，一定程度上优于高黎贡山猪，但不如杂交猪，可能是杂交猪经过有目的的杂交选育后对饲料利用率高。赵桂英等的研究发现，高黎贡山公猪中的瘦肉率、脂比率、眼肌面积分别为45.37%、30.67%、20.43 cm，母猪为44.32%、32.45%、19.68 cm；吴旭东等研究发现，杜保二元杂交猪的瘦肉率、脂比率、眼肌面积分别为57.67%、24.31%、39.32 cm；王海洲等研究发现，五莲黑猪的瘦肉率、脂比率和眼肌面积分别是47.16%、33.35%、30.92 cm，杜长大猪分别是67.55%、14.04%、53.83 cm。本实验中，保山猪的瘦肉率、脂比率、眼肌面积分别为34.3%、44.12%、25.459 cm，瘦肉率低于其他4 个猪种，眼肌面积高于高黎贡山猪而低于其他3 个猪种，脂比率高于其他4 个猪种，推测保山猪体内脂肪的沉积能力优于其他4 个猪种。

本实验结果显示，基因在3 个组织中的表达趋势为背脂>背最长肌>肝脏。丁琳琳研究不同月龄猪基因在心、肝、胃、大肠、小肠、背肌和腿肌等10 个组织中的表达规律，结果显示基因在10个组织中均有表达，且表达趋势均为：背最长肌>肝脏。屈博文等研究指出淮南猪皮下脂肪组织中基因表达水平显著高于背最长肌组织，与本研究结果一致，可能是因为基因在培育猪种、地方猪种中表达量具有一致性。付言峰等的研究表明，基因在苏钟猪皮下脂肪的表达量最高，表达量顺序由高到低依次为：皮下脂肪>背最长肌>肝脏，与本研究保山猪基因的表达趋势一致。张雄在基因对从江香猪脂肪沉积影响的研究中发现，基因在背肌、心脏、肝脏等组织器官中均有表达，且存在组织特异性，其中在背最长肌中的相对表达量最高，与本实验背脂中相对表达量最高的结果不一致。李培培等发现基因在肌肉和骨骼肌组织中相对表达量最高，与本实验结果也不一致。上述研究与本实验结果存在差异的原因可能为：猪种不同，生物学特性会有所不同，同时猪的生长环境、饲养管理方式也会在一定程度上影响基因在各个组织的表达量。

王薇的研究表明，基因的表达量与背膘厚呈正相关，与活体重、眼肌面积呈负相关，本实验中，基因的表达量与保山猪三点背膘厚及宰前活重均无显著的相关性，2 个实验结果不同，可能是品种不同所致，但基因的表达量与保山猪眼肌面积呈显著负相关，2 个实验结果一致。郭勇等检测了猪背最长肌和皮下脂肪组织基因的表达水平，并与胴体性能和肉质性能进行关联分析，结果发现，在背最长肌组织中基因表达量与肌内脂肪、皮厚和背膘厚呈正相关，与眼肌面积呈负相关，其中与肌肉水分含量呈显著负相关，在皮下脂肪组织中基因表达量与皮厚呈显著负相关；廉红霞等在杜长大三元杂交猪基因表达与肌内脂肪含量相关性研究中发现，基因在背最长肌中的表达量与肌内脂肪含量呈极显著正相关，与体重呈正相关；Gerfault 等的研究发现，基因在猪皮下脂肪组织中的高表达能够显著增加猪皮下脂肪的沉积，本研究中，保山猪基因在背最长肌的表达量与皮比率呈极显著负相关，在背脂组织中的相对表达量与眼肌面积呈显著负相关，与脂比率呈显著正相关，符合脂肪、瘦肉在猪体内的生长规律，以上研究可说明基因与调控脂肪的沉积有关，可作为调控脂肪沉积的候选基因。但由于目前纯种保山猪存栏量少，样本获取较为困难，且实验经费有限，本研究只是采用了少量样本进行初步探索，为相关研究提供参考，今后会继续对保山猪进行保育扩繁，待保山猪数量增加，实验资金充足，将扩大实验样本量，进一步验证此结论。

4 结 论

本研究发现，基因在保山猪3 个组织中的相对表达量存在差异，其表达量从高到低依次为：背脂、背最长肌、肝脏。基因的上调表达对保山猪脂肪沉积有促进作用，可作为调控保山猪脂肪沉积的候选基因。