二甲双胍在糖尿视网膜病变治疗中的作用及可能机制△

2022-08-12 03:56朱洪燕魏英丽柯治生
眼科新进展 2022年8期
关键词:内皮细胞外周血视网膜

朱洪燕 魏英丽 柯治生

随着饮食习惯的改变和人口老龄化的加剧,我国糖尿病患病人数显著升高,而糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病患者常见的微血管并发症,严重者可致盲。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物,也是联合治疗2型糖尿病的首选药物[1]。除了降血糖,最新的研究也显示二甲双胍具有抗肿瘤、抗衰老、心血管保护和逆转肺纤维化等作用[2-6]。临床研究显示,相对于其他降血糖药物,二甲双胍能够显著延缓DR的发生[7]。红细胞是人体内最多的血细胞,然而红系细胞与糖尿病眼底病变的相关性目前尚不清楚。有研究报道,DR患者促红细胞生成素(EPO)浓度及EPO受体表达均显著升高,进而促进视网膜新生血管的形成[8]。红系前体细胞(EPCs)是红细胞的干细胞,在维持红系细胞稳定中发挥着关键作用[9]。CD31+亚型EPCs比例与EPO紧密相关,自我增殖和分化为红细胞的能力强,且具有潜在的促血管生成功能[10]。本研究拟探讨二甲双胍通过调控CD31+EPCs在DR治疗中的作用及机制,为其临床预防和治疗的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料以2019年5月至2021年5月在武汉爱尔眼科医院治疗的DR患者作为研究对象。纳入标准:年龄18~65周岁;诊断为2型糖尿病合并眼底病变。排除标准:合并恶性肿瘤;合并严重贫血;合并艾滋病或乙型肝炎等;吸毒或严重酗酒;眼部外伤史;青光眼。按照治疗药物的不同将患者分为两组:胰岛素治疗组(患病期间一直接受胰岛素治疗)和二甲双胍治疗组(患病期间一直接受二甲双胍治疗),每组各35例患者。DR按严重程度可分为非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)。胰岛素治疗组NPDR患者20例,PDR患者15例,二甲双胍治疗组NPDR患者18例,PDR患者17例。选取同期来本院就诊的2型糖尿病但不合并DR的35例患者为糖尿病组。3组患者的性别、年龄、体重、糖尿病患病时间和空腹血糖相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则,经武汉爱尔眼科医院医学伦理委员会批准(批准文号:W20190309),患者均签署知情同意书。

表1 3组患者的一般资料

1.2 主要材料人淋巴细胞分离液购于天津TBD公司;CD31-PE、CD71-APC和TER-119-FITC购于美国BD公司;RPMI1640和胎牛血清(FBS)购于美国Hyclone公司;血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1 )、白细胞介素6(IL-6)和转化生成因子β(TGF-β)的ELISA试剂盒购于厦门慧嘉生物科技公司;MTT、结晶紫和二甲基亚砜购于美国Sigma公司;Transwell小室购于美国Corning公司;血管内皮细胞株购于美国ATCC公司。

1.3 流式细胞术检测收集各组患者空腹时外周血1 mL,加入1 mL生理盐水,轻柔混匀。2 mL人淋巴细胞分离液置于15 mL离心管内,缓慢将外周血加入到分离液上层。1500 r·min-1离心20 min,小心用移液器吸出中间的白膜层,使用生理盐水清洗3次。加入CD31-PE、CD71-APC和TER-119-FITC,轻柔重悬后,避光作用15 min。生理盐水清洗3次,采用流式细胞术检测EPCs和CD31+EPCs的比例。

1.4 ELISA检测收集胰岛素治疗组、二甲双胍治疗组及糖尿病组患者空腹时外周血4 mL,采用流式细胞术分选出免疫抑制细胞(CD71+TER-119+EPCs),置于含有体积分数10%FBS的RPMI1640中培养。48 h后收集各组上清,ELISA检测各组患者EPCs培养上清中VEGF、SDF-1、IL-6和TGF-β的浓度。

1.5 MTT检测取对数生长期的血管内皮细胞,并将其随机分为3组:糖尿病EPCs组(糖尿病组患者外周血EPCs与血管内皮细胞共培养48 h)、胰岛素治疗EPCs组(胰岛素治疗组患者外周血EPCs与血管内皮细胞共培养48 h)和二甲双胍治疗EPCs组(二甲双胍治疗组患者外周血EPCs与血管内皮细胞共培养48 h)。收集各组血管内皮细胞,以每孔5×103个接种于96孔板中,继续培养24 h。加入5 g·L-1的MTT,继续培养4 h。弃上清,加入150 μL的二甲基亚砜,轻柔振荡10 min后,在酶联免疫检测仪上测定570 nm处各孔光密度。

1.6 细胞迁移实验采用Transwell小室检测各组血管内皮细胞的迁移能力及划痕愈合率。取分选后的EPCs置于小室下层,2×104个血管内皮细胞置于小室上层,按1.5方法分组处理后继续培养24 h,取出Transwell小室,小心抹去Transwell膜上层的细胞,之后使用10 g·L-1结晶紫染色5 min。生理盐水清洗3次后显微镜下观察,计算各组细胞迁移率和划痕愈合率。

1.7 统计学方法数据采用GraphPad 5.0进行统计分析,多组间比较采用方差分析,两组间的比较采用t检验,事后检验采用Boferroni检验。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 3组患者外周血EPCs的分析糖尿病组、胰岛素治疗组、二甲双胍治疗组患者外周血EPCs的比例分别为0.75%±0.03%、0.73%±0.02%和 0.72%±0.02%,3组患者外周血EPCs的比例相比,差异无统计学意义(F=1.194,P=0.544)(图1)。

2.2 3组患者外周血CD31+EPCs的分析糖尿病组和胰岛素治疗组患者外周血CD31+EPCs的比例分别为0.24%±0.01%和0.34%±0.01%,组间相比差异具有统计学意义(t=5.486,P<0.001);二甲双胍治疗组患者外周血CD31+EPCs的比例为0.21%±0.01%,与胰岛素治疗组比较,差异具有统计学意义(t=6.497,P<0.001),与糖尿病组比较,差异无统计学意义(t=0.963,P=0.414)(图2)。

图2 流式细胞术分析各组患者外周血CD31+EPCs

2.3 3组患者外周血EPCs分泌对促血管生成因子的影响糖尿病组、胰岛素治疗组患者外周血EPCs培养上清中VEGF的浓度分别为(1.58±0.08)μg·L-1和(2.83±0.10)μg·L-1,SDF-1的浓度分别为(0.58±0.05)μg·L-1和(1.48±0.14)μg·L-1,两组相比差异均有统计学意义(t=9.497、5.993,均为P<0.001);二甲双胍治疗组患者外周血EPCs培养上清中VEGF和SDF-1的浓度分别为(1.07±0.09)μg·L-1和(0.35±0.08)μg·L-1,与胰岛素治疗组比较,差异均有统计学意义(t=12.853、7.117,均为P<0.001),与糖尿病组比较,差异均无统计学意义(t=7.667、8.969,P=0.372、0.551)。糖尿病组、胰岛素治疗组和二甲双胍治疗组患者外周血EPCs培养上清中IL-6的浓度分别为(3.55±0.19)μg·L-1、(3.48±0.20)μg·L-1和(3.56±0.25)μg·L-1,TGF-β的浓度分别为(0.17±0.02)μg·L-1、(0.22±0.03)μg·L-1和(0.25±0.02)μg·L-1,3组间相比差异均无统计学意义(F=0.061、0.293,P=0.941、0.074)。

2.4 3组患者外周血EPCs对血管内皮细胞的影响糖尿病EPCs组血管内皮细胞的增殖率为 14.04%±1.26%,胰岛素治疗EPCs组血管内皮细胞的增殖率为27.36%±1.19%,差异具有统计学意义(t=7.685,P<0.001);二甲双胍治疗EPCs组血管内皮细胞的增殖率为12.17%±1.08%,与胰岛素治疗EPCs组比较,差异具有统计学意义(t=9.461,P<0.001),与糖尿病EPCs组比较,差异无统计学意义(t=1.221,P=0.372)。

糖尿病EPCs组血管内皮细胞的迁移率为 3.23%±0.26%,胰岛素治疗EPCs组血管内皮细胞的迁移率为5.57%±0.31%,差异具有统计学意义(t=5.780,P<0.001);二甲双胍治疗EPCs组血管内皮细胞的迁移率为1.72%±0.20%,与胰岛素治疗EPCs组、糖尿病EPCs组比较,差异均有统计学意义(t=10.574、0.934,均为P<0.001)(图3)。

图3 Transwell小室检测各组患者外周血EPCs对血管内皮细胞迁移的影响

糖尿病EPCs组血管内皮细胞划痕愈合率为 27.65%±2.38%,胰岛素治疗EPCs组血管内皮细胞划痕愈合率为55.50%±2.64%,差异具有统计学意义(t=7.834,P<0.001);二甲双胍治疗EPCs组血管内皮细胞划痕愈合率为27.36%±1.94%,与胰岛素治疗EPCs组比较,差异具有统计学意义(t=8.586,P<0.001),与糖尿病EPCs组比较,差异无统计学意义(t=1.467,P=0.296)。

3 讨论

糖尿病是一组因胰岛素分泌缺陷或作用受损引起的以高血糖为主要特征的全身代谢性疾病。近几年,我国糖尿病的患病人数呈快速上升和年轻化趋势,给家庭以及社会带来了沉重负担。血管并发症是糖尿病最严重和常见的并发症,包括心脑血管疾病、内脏器官并发症和眼底视网膜病变等[11]。DR是我国居民致盲的主要原因之一,目前尚无有效的治疗手段,因此,寻找新的靶点预防DR具有重要的临床意义。

二甲双胍治疗糖尿病的机制是多途径的,包括抑制肝糖生成和输出、改善糖摄取以及调控胰岛素代谢等,目前已被应用于2型糖尿病的一线治疗。近几年大量研究显示,二甲双胍还具有抗癌、调控免疫反应、抗抑郁和抑制肺纤维化等重要作用[12-14]。此外,二甲双胍在缓解DR中也显示出广阔的应用前景。临床研究结果显示,相对于胰岛素,二甲双胍治疗可显著降低DR的发生,缓解糖尿病引起的视力下降[15]。这可能是由于二甲双胍减少了视网膜损伤,减少了视网膜静脉阻塞,减少了视网膜新生血管的形成及减轻了视网膜炎症反应等所致[16]。本研究结果显示,二甲双胍虽然对EPCs的影响不明显,但可以显著降低糖尿病患者外周血CD31+EPCs的比例。体外实验结果发现,二甲双胍可抑制EPCs分泌VEGF和SDF-1,削弱血管内皮细胞的增殖和迁移,最终达到预防DR的效果。但有关二甲双胍防治DR的具体作用机制还需要进一步实验研究进行探讨。

在EPO的作用下,EPCs可自我更新、分化为红系细胞,同时也是维持红系细胞稳态的重要干细胞。依据表面标志和生物学功能的不同,EPCs可进一步分化为数种亚型。有研究发现,CD31可以定义一种EPCs亚型,CD31+EPCs具有较强的自我增殖和分化能力[17]。本研究结果显示,相对于糖尿病无DR者,DR患者外周血EPCs的比例没有显著变化,然而CD31+EPCs的比例显著升高。体外研究发现,CD31+EPCs具有很好的促血管生成能力,能够分泌大量的血管生成因子,如VEGF和SDF-1,VEGF为最强的促血管生成因子,SDF-1则是内皮祖细胞动员和归巢的关键因子[18-19],二者共同促进血管内皮细胞增殖和迁移,进而诱导血管生成;而且二甲双胍可影响VEGF下游信号的转导,减少视网膜血管内皮细胞的增殖和迁移,以达到抗血管生成作用[20]。这提示CD31+EPCs可能是诱导DR的重要因素之一,其具体的作用机制还需要进一步研究。

综上,二甲双胍通过降低糖尿病患者CD31+EPCs比例,延缓眼底病变的进展,本研究为DR的预防和治疗提供了新的靶点。

猜你喜欢
内皮细胞外周血视网膜
有氧运动和精氨酸补充对高血压的干预作用及其与内皮细胞功能的关系
深度学习在糖尿病视网膜病变诊疗中的应用
眼库获取的角膜内皮细胞密度变化规律及影响因素研究△
如何防治裂孔性视网膜脱离
外周血G6PD活性检测对于感染高危型人乳头瘤病毒宫颈癌患者的诊断预后价值
上调SIRT1减少同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞凋亡
视网膜脱离相关知识,你了解多少?
“糖衣”告诉细胞何时造血
什么是外周血管超声检查
什么是外周血管超声检查