微生物菌剂对小麦抗病能力的影响

丁钱华

(1.杭州萧山丁家庄农机专业合作社,浙江 杭州 311256;2.浙江农艺师学院,浙江 杭州 310021)

由真菌、细菌、病毒、线虫和原生动物等各种植物病原微生物引起的农作物病害会严重影响全球范围内的农业生产,同时导致粮食产量与粮食安全的大幅下降。20%～40%的农作物产量损失是由病原微生物感染引起的[1]。减少农作物病害发生的防治措施目前主要有一系列农药的使用以及抗性作物的研发等,但是这两者都存在一定的局限性。过度使用合成农药会对环境和其他非靶标生物产生不良影响,扰乱生态系统功能,降低农业生产的可持续性[2]。2022 年1 月,中央五部门联合印发 《农业农村污染治理攻坚战行动方案 (2021—2025年) 》,强调要深入实施化肥农药减量增效行动。抗性作物虽然具有很强的抗病能力,但是往往产量不如普通作物,需要考虑产量与抗病性的平衡[3]。因此,亟需一种更加稳定、可靠以及环境友好型的农作物病害防治措施。利用微生物进行农作物病害的防治是一种创新的方法,不仅能够直接对植物病原体产生拮抗作用,更能够全面提高农作物的抗病能力[4]。生物防治的定义是利用有益微生物减少病原微生物对农作物的负面影响以及提升农作物免疫能力[5]。

小麦 (TriticumaestivumL.) 作为世界三大谷物之一,供给着世界三分之一的人口,是世界范围内重要的粮食作物之一。随着世界人口持续不断的增长,人们对小麦产量的提升也提出更高的要求。但是,小麦生产过程中非常容易遭受根腐病、全蚀病以及纹枯病等土壤病害的侵害,导致产量受损,进而影响粮食供给[6]。秸秆还田本身是一种能够维持田间养分平衡的新耕作方式,近几年来被广泛推广。但是,目前越来越多的研究证据表明,秸秆还田会显著地提升土壤中植物病原菌的富集,增加小麦的病害风险[7]。为降低秸秆还田后小麦土传病害的发生,全面提高小麦抗病能力,同时又积极响应落实国家相关农药减量政策,本研究从生物防治角度,重点研究了多种微生物菌剂复合施用对小麦抗病能力的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验在杭州市萧山区的小麦试验田中进行,试验田总面积2.1 hm2,有2 a 秸秆还田历史,肥力较好,未施用过杀菌剂以及微生物菌剂。供试小麦品种为扬麦20 号。试验使用的3 种微生物菌剂均为颗粒剂,主要成分分别为枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisB1514)、胶冻样 芽孢杆 菌(Bacillusmucilaginous) 以及巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。对照药剂为3%苯醚甲环唑悬浮种衣剂,购于河南浩迪农业科技有限公司。

1.2 处理设计

试验共设置3 个微生物菌剂单独施用处理、1个微生物菌剂复合施用处理、1 个药剂对照以及1个未添加任何菌剂及药剂的空白对照:CK,未添加任何菌剂及药剂的空白对照组;Dif,3%苯醚甲环唑悬浮种衣剂处理种子;B1,枯草芽孢杆菌单独施用;B2,胶冻样芽孢杆菌单独施用;B3,巨大芽孢杆菌单独施用;Bmix,微生物菌剂复合施用。每个处理设置3 个重复,每个重复试验田面积为225 m2(15 m×15 m)。小麦于2020 年9 月26日播种,2021 年6 月20 日成熟收获,然后进行室内考种。药剂对照组采用拌种方法处理小麦种子,药剂与种子质量的比例为1∶40,拌种、风干后播种 (现拌现用)。其他处理组与对照组种子均用清水做相同处理。4 组微生物菌剂施用组均拌入底肥中,采用沟施方法进行,有效活菌数量≥10 亿·mL-1。其中,微生物复合施用组为3 种微生物菌剂1∶1∶1 混合。小麦种植期间采用统一的肥水管理方案:施用底肥纯氮120 kg·hm-2,P2O5112.5 kg·hm-2、K2O 11.2 kg·hm-2。

1.3 小麦生长指标与产量测定

小麦在成熟收获后根据室内考种结果统计各生长指标。对照组与处理组每个重复各取10 株,测定株高、次生根数、有效穗数、穗粒数以及千粒重。有效穗数为单株剔除5 粒以下小穗的麦穗数量;穗粒数为单株随机从根部选取20 个分蘖,剔除小穗后记录的穗粒数;千粒重为1 000 粒穗粒质量。根据这3 项指标计算理论产量:理论产量=(有效穗数×穗粒数×千粒重)/106×0.85。

1.4 小麦病害调查

在小麦成熟期以5 级分类法分别统计小麦根腐病、全蚀病以及纹枯病的病害情况。并分别计算病害指数和防治效果:病害指数=∑ (各级病株率×相对级数值)/ (调查总株数×发病最高病级);防治效果=(空白对照组病情指数-处理组病情指数)/空白对照组病情指数×100%。

1.5 小麦植物抗病基因表达量测定

称取0.2 g 小麦成熟期根部样品,用1 000 μL RNA 保护液 (Trizol Reagent,B610409-0100,生工生物工程上海股份有限公司) 研磨、提取RNA。氯仿200 μL,振荡器上振荡15～30 s,冰上放置5 min 后4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min,取最上层200 μL 到新离心管。加入200 μL 异丙醇,上下颠倒温和混匀,冰上放置10 min 后4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min,去上清。加入1 mL 75%的乙醇洗涤,4 ℃ 8 000 r·min-1离心3 min,去上清,重复两次。RNA 沉淀晾干后加入20 μL 超纯水溶解,使用逆转录试剂盒 (HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper),诺唯赞有限公司)反转录成cDNA。使用不同引物 (表1) 进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 试验。

表1 基因引物序列

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂对小麦生长的影响

从表2 可以看出,与对照相比,微生物菌剂能够显著提高小麦的株高和次生根数,其中,复合微生物菌剂表现最佳。单一施用组中,胶冻样芽孢杆菌施用后小麦株高和次生根数的增加量相比于其他两个菌剂更大。药剂对照组也能够显著提升小麦株高,但是会减少次生根数量。

表2 微生物菌剂对小麦生长指标的影响

2.2 微生物菌剂对小麦产量的影响

从表3 可以看出,与对照相比,微生物菌剂能够显著提高小麦的产量,其中,复合微生物菌剂表现最佳,增产率达到59.4%。单一施用组中,胶冻样芽孢杆菌的施用对小麦产量的增加相比于其他两个菌剂更大。药剂对照组也能够显著提升小麦产量,这可能与其杀菌效果有关,能够抑制小麦病害发生从而达到产量提升的目标。

表3 微生物菌剂对小麦产量的影响

2.3 微生物菌剂对小麦病情的影响

从表4 可以看出,与对照相比,微生物菌剂能够显著降低小麦多种病害,其中,复合微生物菌剂表现最佳,对根腐病、全蚀病和纹枯病的防治效果分别达到68.9%、69.8%和63.4%。单一施用组中,胶冻样芽孢杆菌的施用对小麦土传病害防治效果相比于其他2 个菌剂更佳。药剂对照组相比于微生物菌剂防治效果更佳,复合微生物菌剂能够与其具有相近的效果。

表4 微生物菌剂对小麦病情的影响

2.4 微生物菌剂对小麦免疫基因表达的影响

为观察微生物菌剂对小麦免疫力的影响,利用qRT-PCR 技术分析了5 个关键免疫基因的表达量(图1)。所有微生物菌剂施用组都能够上调多个小麦免疫基因的表达。单一微生物菌剂处理中,巨大芽孢杆菌促进免疫表达的能力显著小于枯草芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌对PDF1.2、WRKY29 基因表达的上调作用高于其他两种菌剂单独施用,而胶冻样芽孢杆菌对PR1、PR2 基因表达的上调作用在单独微生物菌剂施用组中最大。相比于单独施用微生物菌剂,复合微生物菌剂对小麦免疫能力的提升更大。PR1、PR2、PDF1.2、ERF1、WRKY29 基因在复合微生物菌剂处理组中表达量分别为空白对照组的3.4、2.8、1.5、3.9、5.8 倍。与微生物菌剂处理不同,药剂对照组中部分小麦免疫基因相比于空白对照组显著下调,包括PR1(下调40.4%) 和WRKY29 (下调49.7%)。

图1 微生物菌剂对小麦免疫基因表达的影响

3 小结与讨论

小麦土传病害,包括本试验中重点考虑的根腐病、全蚀病以及纹枯病是造成小麦产量降低的重要原因。近年来,由于秸秆还田新耕作方式的推广,反而增加了土壤中有害病原体的丰度,造成小麦土传病害发病率的不断提升[7]。本试验中使用的试验田具有秸秆还田史,其中,空白对照组小麦根腐病、全蚀病以及纹枯病病情严重,进一步证实了秸秆还田对土传病害的不利影响。

化学药剂的施用,主要是杀菌剂,如本试验药剂对照组中施用的苯醚甲环唑,会产生一系列不利后果。比如本试验结果表明,杀菌剂的施用虽然由于其更直接的杀菌作用促进小麦病害的防治以及产量的提升,但是并不能提升小麦的免疫能力。相反,杀菌剂的施用会抑制小麦根部生长以及部分免疫功能,不利于后代的生长。除此之外,化学药剂的施用会在环境中产生药物残留,造成环境污染,也会引起病原体的耐药性,不利于防治工作的持续开展[8]。

本试验结果表明,微生物菌剂均能够显著提升小麦株高和次生根数,这两个生长指标分别对应了地上部分和地下部分的生长情况。此外,微生物菌剂能够显著提升小麦的产量。先前已有诸多研究表明,有益微生物菌剂的施用能够促进植物的生长与产量。王剑等[9]研究表明,在有机肥施用过程中配施解淀粉芽孢杆菌能够显著提升大棚草莓的成活率及产量,并能够有效改良土壤。侯栋等[10]在辣椒生长过程中,利用功能型混合微生物菌剂配施化肥的方式成功达到了化肥减量增效的目标。李文略等[11]研究结果也表明,微生物菌肥不仅能够提高绿芦笋产量,还能进一步提升其品质,主要表现在可溶性蛋白和可溶性糖含量的增加。

利用微生物菌剂进行植物病害防治的研究已有较多报道,尤其是芽孢杆菌。王丽丽等[12]从黄瓜枯萎病高发地区的健康土壤中分离得到了芽孢杆菌菌株15,室内和室外试验结果一致地表明该菌株能够显著抑制甜瓜根腐病与西瓜枯萎病。常娜等[13]以枯草芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌为试验菌株,验证了其对不同地区小麦纹枯病、根腐病以及全蚀病的抑制作用,指出微生物菌剂对病原菌的拮抗作用和对小麦营养吸收的促进作用可能是缓解小麦病情的主要原因。

本试验结果也揭示了化学药剂与微生物菌剂缓解小麦病害的不同机制。化学药剂主要依赖于对病原体的直接消杀从而达到防治病害的作用。而微生物菌剂则能够促进小麦免疫应答,从而增强小麦对病原体的抵抗能力。先前研究也有类似报道,在康乃馨根中接种荧光假单胞菌WCS417r,显著增强了康乃馨对尖孢镰刀菌的抗性,并增强了病原菌感染部位植物抗菌素的积累[14]。Smigielskl 等[15]研究表明,为蒺藜苜蓿接种丛枝菌根真菌能够显著增加其对黄单胞菌的抗性。Pieterse 等[16]在2014 年的开创性研究中发现,有些病原菌与有益菌没有直接联系,表明植物抗病是通过植物调节的免疫应答引起的。有益微生物相关分子是常见的免疫激发子,如几丁质、鞭毛蛋白和脂多糖,它们可以被植物模式识别受体感知从而激发相应的免疫反应。有些微生物能够分泌植物激素 (如生长素与细胞分裂素)而被植物激素信号识别。

本试验结果还表明,不同微生物菌剂对小麦抗病性的影响程度不同,3 种不同假单胞菌菌剂单独施用时,胶冻样芽孢杆菌对小麦病情的防治效果最佳。将不同的微生物菌剂进行复合施用,能够达到协同的效果,从而最优化小麦病害防治效果。Raupach 等[17]研究中也有类似结果报道,由短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌组成的有益菌群能够产生协同效应,增强了黄瓜对病原体的抗性。