赖氨藤黄酸通过诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡增强顺铂的抗肿瘤作用

牛洁，刘璞，张鑫，郭君，魏洁，林雅军

·论著·

赖氨藤黄酸通过诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡增强顺铂的抗肿瘤作用

牛洁，刘璞，张鑫，郭君，魏洁，林雅军

100730 北京大学第五临床医学院（牛洁、林雅军）；100730 北京医院/国家老年医学中心/国家卫生健康委北京老年医学研究所/国家卫生健康委老年医学重点实验室/中国医学科学院老年医学研究院（刘璞、张鑫、郭君、魏洁、林雅军）

探讨赖氨藤黄酸（GAL）增强顺铂（DDP）抑制人类宫颈癌 HeLa 细胞增殖的作用机制。通过平板克隆形成实验测定 GAL 对 HeLa 细胞的增殖抑制作用；用不同浓度DDP 和（或）GAL 分别处理 HeLa 细胞，通过 MTT 法检测细胞增殖抑制作用；流式细胞术检测 HeLa 细胞凋亡百分率；Hoechst 染色观察 HeLa 细胞的凋亡形态学变化；Western blot 从蛋白质水平检测凋亡相关分子 caspase-3、cleaved-caspase-3、PARP、cleaved-PARP 的表达。GAL 能够浓度依赖性抑制 HeLa 细胞克隆形成。GAL 可显著增加 DDP 诱导的细胞凋亡，从（56.9 ± 7.78）%增加到（74.4 ± 9.53）%。Hoechst 染色发现，与对照组相比，GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L 联合处理组，核浓缩和核边集的凋亡细胞显著增多，而且出现分叶状和碎片状核。与对照组相比，GAL 0.5 μmol/L + DDP 5 μmol/L 组、GAL 1.0 μmol/L、DDP 10 μmol/L 以及 GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L 组 cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP 表达水平升高（< 0.05），而GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L 组 caspase-3 表达水平降低（< 0.05）。GAL 通过增加 DDP 诱导的 HeLa 细胞凋亡来增强 DDP 的抗肿瘤作用，可以作为 DDP 诱导 HeLa 细胞凋亡的增强剂。

赖氨藤黄酸； 顺铂； 宫颈癌； 凋亡

宫颈癌是女性生殖系统的第四大常见癌症类型，全世界每年有 50 多万新发病例，且发病率逐年上升，并呈年轻化趋势[1]。此外，宫颈癌还是发展中国家妇女中最常见的癌症之一[2]。虽然医疗技术不断进步，但宫颈癌仍然是影响中年妇女的一个主要公共卫生问题。手术加放疗可显著改善宫颈癌早期的治疗效果，但对于晚期、复发、转移患者的治疗仍存在瓶颈，晚期癌症患者的 1 年期生存率 < 20%[3]。顺铂（DDP）是目前宫颈癌化疗的一线抗肿瘤药物，但单纯使用顺铂的有效率只有 55%[4]。为此我们尝试从中药中寻找既有抗肿瘤活性又能增加顺铂疗效的化合物。

藤黄酸（GA）是藤黄属植物提取物，近期多项研究表明，GA 能够通过促进癌细胞凋亡进而发挥抗癌作用，但GA 有不易溶于水的缺点，使其临床应用受限，本实验室自主研发的赖氨藤黄酸（GAL）既保留了GA 的活性化学基团，同时又解决了GA 不易溶于水的难题[5]。然而GAL 对宫颈癌的作用效果及机制，以及是否能够协同 DDP 治疗宫颈癌仍然没有系统性研究。本文的目的是研究GAL 对 DDP 诱导宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的促进作用，为两者在临床上的联合应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞株 HeLa 由中国医学科学院细胞库提供；DMEM 培养基、胰蛋白酶、赖氨酸（纯度≥ 98%）购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；GA（纯度≥ 98%）购自南京景竹生物科技有限公司；GAL 由本室合成；DDP由齐鲁制药（海南）有限公司提供；AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）试剂盒购自美国BD 公司；半胱氨酸蛋白酶蛋白32（caspase-3）、cleaved-caspase-3（C-caspase-3）、PARP、cleaved-PARP（C-PARP）、β-actin 购自美国 Cell Signaling Technology 公司；HRP 标记的山羊抗兔 IgG 购自美国 Santa Cruz 公司；二甲基亚砜（DMSO）、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自美国 Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将 HeLa 细胞进行常规复苏后，在 25 cm2细胞培养瓶中用含有 10% 胎牛血清、100 U/ml 链霉素、100 U/ml 青霉素的 DMEM 进行培养。再将培养瓶置于 5% CO2的 37 ℃恒温培养箱中培养，细胞融合至 80% 后进行传代培养。细胞传代用 0.25% 的胰蛋白酶消化。

1.2.2 平板克隆形成实验 用 0.25% 胰蛋白酶消化 HeLa 细胞并制备单细胞悬液。接种 1000 个细胞于 6 孔板中，加入 2 ml 含 10% FBS 的 DMEM 完全培养基，摇匀，培养 24 h 后分别加入0、0.5 和 1.0 μmol/L 的 GAL 处理。每个浓度设3 个平行样本，每 3 天换液一次，于 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养 7 d，计数克隆形成率。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖 将对数生长期的宫颈癌 HeLa 细胞配制成15 000 个/ml 培养液。取 200 μl 细胞悬液接种至 96 孔板，置于 5% CO2的37℃培养箱中培养 24 h，然后每孔分别加入 0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L 的 GAL 或GA（用 DMSO 溶解），或0、5、10、20、40、80 μmol/L的 DDP。每组设置 6 个复孔，培养 48 h 后每孔加入 20 μl 浓度为 5 mg/ml 的 MTT 溶液，置于 37 ℃恒温培养箱反应 4 h，弃去培养基，每孔加入 150 μl 的 DMSO 溶液，避光反应 10 min，置酶标仪于 490 nm 测定各孔的光密度值（）。细胞存活率 =（实验组值 – 空白组值）/（阴性对照组值 – 空白组值）× 100%。应用 GraphPad Prism5 软件计算 IC50值。

1.2.4 药物相互作用的计算 通过计算药物相互作用系数（CDI）来判断两种药物联用时是否存在协同作用。CDI = AB/（A × B），其中 AB 是联合用药组与对照组比较的存活率，A 和 B 分别是相对单药组与对照组比较的存活率。CDI > 1 表示两药有拮抗作用；CDI < 1 表示两药有协同效应，CDI < 0.7 表示有显著的协同作用；CDI = 1 表示两药有相加效应[6]。

1.2.5 流式细胞术检测 HeLa 细胞凋亡率 取对数生长期的 HeLa 细胞，以 2 × 105个/孔接种于 60 mm 培养皿，培养 48 h 后弃去培养基，设置实验组 GAL 终浓度为 0.5、1.0 μmol/L；DDP终浓度为 5、10 μmol/L；联合组终浓度为 GAL0.5 μmol/L + DDP 5 μmol/L，GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L；并设置不加 GAL 或DDP 的阴性对照组。于加药后 48 h 终止干预。参照 Annexin V-FITC/PI 试剂盒操作说明书进行操作，弃去培养基，PBS 清洗1 次，用不含 EDTA 的胰酶消化，PBS 洗 3 次，将细胞重悬于 200 μl 1 × binding buffer 重悬细胞，各培养皿依次加入 Annexin V-FITC 和 PI 液各5 μl 混匀，室温避光反应15 min，再加入 300 μl1 × binding buffer，混匀后室温孵育 15 min 测定凋亡率。

1.2.6 Hoechst 染色法观察细胞凋亡形态 取对数生长期的 HeLa 细胞，以 1.5 × 104个/孔接种于 24 孔板，培养 24 h 后弃去培养基。实验分组和药物浓度同“1.2.5”。孵育 48 h 后，用 PBS 清洗细胞后，然后用多聚甲醛固定 15 min，弃去多聚甲醛，并用 PBS 清洗，每次 3 min，洗 3 次。每孔加入 500 μl 新鲜培养基，加入 5 mg/ml 的 Hoechst33258 染液使其终浓度为 5 μg/ml，将细胞培养板避光放置于 37 ℃恒温培养箱中，避光孵育30 min。染色完成后，弃去染液，并用 PBS 清洗3 次。最后在避光条件下用荧光倒置显微镜进行观察，并拍照记录。

1.2.7 Western blot 检测凋亡相关蛋白表达 将药物联合作用分为对照组、GAL 0.5 μmol/L、DDP 5 μmol/L、GAL 0.5 μmol/L + DDP 5 μmol/L、GAL 1.0 μmol/L、DDP 10 μmol/L、GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L，分别药物处理 HeLa 细胞 48 h。按照蛋白提取试剂盒要求配制细胞总蛋白裂解液，加入含有 PMSF 和蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液，在冰上静置 20 min。用 BCA 试剂盒测量蛋白质浓度。用 10% SDS-聚丙烯酰胺分离 20 μg 总蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在室温下用5% 脱脂奶粉封闭 2 h。然后用相应一抗（caspase-3、C-caspase-3、PARP、C-PARP、β-actin，1:1000 稀释）在 4 ℃孵育过夜，经 3 次 TBST 洗涤后，将膜在 HRP 偶联的二抗（1:5000）中室温孵育2 h。使用增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂使蛋白质可视化，将 PVDF 膜在凝胶成像系统上进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 GAL抑制宫颈癌 HeLa 细胞增殖

细胞克隆形成实验结果表明，GAL 能够浓度依赖性抑制 HeLa 细胞克隆形成，GAL 1.0 μmol/L导致 HeLa 细胞不能形成克隆（图 1）。此外 MTT 检测细胞增殖活力实验表明，GAL、GA 或 DDP 能够浓度依赖性抑制 HeLa 细胞增殖，作用 48 h 的 IC50分别为 1.36 μmol/L（GAL 与 GA 的 IC50值相当）（图 2A）和 11.5 μmol/L（图 2B）。当选择亚细胞毒性浓度（0.5 μmol/L）的 GAL 与不同浓度的 DDP 联用时，通过 CDI 公式计算发现 CDI 值分别为 0.93 和 0.95，均小于 1，表明具有协同细胞毒作用。当选择 1.0 μmol/L 的 GAL 与不同浓度的 DDP 联用时，CDI 值分别为 0.76 和0.55，均小于1，表明也具有协同细胞毒作用。尤其是 1.0 μmol/L 的 GAL 与 10 μmol/L 的 DDP 联用时的 CDI 值小于 0.7，表明具有显著协同细胞毒作用（图 2C）。

图1 GAL浓度依赖性抑制 HeLa 细胞克隆形成（100 ×）（A：对照组；B：GAL 0.5 μmol/L；C：GAL 1.0 μmol/L）

Figure 1 GAL inhibited colony formation of HeLa cell in concentration-dependent manner (100 ×) (A: Control; B: GAL 0.5 μmol/L; C: GAL 1.0 μmol/L)

图2 GAL、GA、DDP 对 HeLa 细胞增殖的抑制作用及三者的协同作用（A：GAL 和 GA 对 HeLa 细胞增殖的抑制作用；B：DDP 对 HeLa 细胞增殖的抑制作用；C：GAL 0.5 和 1.0 μmol/L 与不同浓度 DDP 联用时对 HeLa 细胞增殖的抑制作用）

Figure 2 The inhibitory effect of GAL, GA and DDP on HeLa cell proliferation and their synergism (A: Inhibitory effect of GAL and GA on HeLa cell proliferation; B: Inhibitory effect of DDP on HeLa cell proliferation; C: Inhibitory effect of GAL 0.5 and 1.0 μmol/L and different concentrations of DDP on HeLa cell proliferation)

2.2 Annexin V-FITC/PI 染色检测 GAL、DDP 单用及联用对细胞凋亡率的影响

流式细胞仪分析显示，GAL、DDP 单独处理以及联用均能显著增加 HeLa 细胞凋亡。1.0 μmol/L的 GAL 能够增强 DDP 的促凋亡作用，并使晚期凋亡的细胞显著增多，从而使 DDP 单独处理时的凋亡率（56.9 ± 7.78）% 增加到两者联用时的（74.4 ± 9.53）%（图 3）。

2.3 Hoechst 染色检测 GAL、DDP 单用及联用对 HeLa 细胞凋亡形态的影响

Hoechst 染色结果（图 4）显示，与对照组 HeLa 细胞（内有形态规则的、蓝染较深的细胞核）相比，GAL 1.0 μmol/L 处理后，部分 HeLa 细胞核显示浓缩和边集，表明部分细胞出现晚期凋亡，与Annexin V-FITC/PI 染色后经流式细胞仪检测结果一致；DDP 10 μmol/L + GAL 1.0 μmol/L 联合处理组，浓缩和边集的凋亡细胞显著增多，而且出现分叶状和碎片状核，说明两者联用能够明显促进HeLa 细胞的晚期凋亡；而 DDP 10 μmol/L 处理组没有出现明显晚期凋亡形态。通过凋亡细胞计数显示 GAL 1.0 μmol/L、DDP 10 μmol/L 和 DDP 10 μmol/L + GAL 1.0 μmol/L 的晚期凋亡率分别为（9.1 ± 2.1）%、（1.1 ± 0.27）%、（21.4 ± 2.67）%，对照组为（0.5 ± 0.5）%。

图3 GAL、DDP 单独及联用对 HeLa 细胞凋亡的促进作用[A：流式检测 GAL、DDP 低剂量单用及联用对宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的影响；B：宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率（*P < 0.05）；C：流式检测 GAL、DDP 高剂量单用及联用对宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的影响；D：宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率（*P < 0.05）]

Figure 3 Promotion of GAL, DDP alone and their combination on HeLa cell apoptosis [A: Effects of low doses of GAL, DDP alone and their combination on apoptosis of cervical cancer HeLa cells were detected by flow cytometry; B: Cervical cancer HeLa cells apoptosis rate (*< 0.05); C: Effects of high doses of GAL, DDP alone and their combination on apoptosis of cervical cancer HeLa cells were detected by flow cytometry; D: Cervical cancer HeLa cells apoptosis rate (*< 0.05)]

图4 Hoechst 染色观察 GAL、DDP 单用及联用对 HeLa 细胞凋亡形态的影响（100 ×）（A：空白对照；B：GAL 1.0 μmol/L；C：DDP 10 μmol/L；D：GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L；E：细胞凋亡率的统计图，与对照组比较*P < 0.05）

Figure 4 Hoechst staining was used to observe the effects of GAL and DDP alone or in combination on the apoptosis morphology of HeLa cells (100 ×) (A: Blank control; B: GAL 1.0 μmol/L; C: DDP 10 μmol/L; D: GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L;E: Statistical graph of apoptosis rate, compared with control group*< 0.05)

图5 GAL、DDP 单用及联用对凋亡相关蛋白C-caspase-3、caspase-3、C-PARP、PARP 表达水平的影响（A：Western blot；B：GAL 0.5 μmol/L、DDP 5 μmol/L及两者联用的相对光密度值；C：GAL 1.0 μmol/L、DDP 10 μmol/L 及两者联用的相对光密度值）（*P < 0.05，与对照组比较）

Figure 5 C-caspase-3, caspase-3, C-PARP, PARP expression levels after GAL or DDP alone or in combination (A: Western blot;B: The relative optical density of GAL 0.5 μmol/L, DDP 5 μmol/L and their combination; C: GAL 1.0 μmol/L, DDP 10 μmol/L and their combined relative optical density) (*< 0.05, compared with the control group)

2.4 GAL、DDP 单用及联用对 HeLa 细胞凋亡相关信号通路的影响

Western blot 检测结果显示，与对照组比较、GAL 0.5 μmol/L + DDP 5 μmol/L 组C-caspase-3 和C-PARP 表达水平升高（< 0.05）；而 GAL0.5 μmol/L、DDP 5 μmol/L 单独治疗组没有显著差异（> 0.05）。与对照组相比，GAL1.0 μmol/L、DDP 10 μmol/L 以及 GAL 1.0 μmol/L+ DDP10 μmol/L 组C-caspase-3 和C-PARP 表达水平升高（< 0.05），而 GAL 1.0 μmol/L + DDP10 μmol/L 组 caspase-3 表达水平降低（< 0.05），如图 5所示。

3 讨论

在全球范围内，宫颈癌以其每年50 多万的新发病例[7-8]给社会和家庭带来了沉重的经济负担[9-11]。临床上宫颈癌的治疗主要以铂为基础的化疗为主，但由于其耐药导致化疗效果不理想。寻找治疗宫颈癌的新药是亟待解决的问题。GA 为藤黄科植物藤黄树脂中的主要活性成分之一[12-13]。大量研究报道，GA 能抑制多种肿瘤细胞的生长[14-18]。但 GA 具有溶解性较差的缺点，一度阻碍其临床应用。本实验采用由本实验室自主合成的 GAL 干预人类宫颈癌 HeLa 细胞，GAL 既保留了 GA 的作用基团，同时增加了其水溶性。结果显示，与空白对照组相比，GAL 能够浓度依赖性地抑制 HeLa 细胞克隆形成，并且其抑制 HeLa 细胞增殖活性明显强于 DDP。通过 CDI 计算药物相互作用时，发现 GAL 与 DDP 联用时表现出协同作用。因此选取了 GAL 0.5 μmol/L + DDP 5 μmol/L 为小剂量，GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L 为大剂量用于后续凋亡实验。

诱导细胞凋亡在 DDP 治疗宫颈癌疾病中发挥着关键作用。Annexin V 能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸特异性结合，PI 能够在凋亡晚期阶段透过细胞膜使细胞核红染。我们通过 Annexin V-FITC/PI 染色后经流式细胞仪检测，发现 DDP 主要诱导 HeLa 细胞发生早期凋亡，GAL 不但可以诱导 HeLa 细胞发生早期凋亡，还能诱导其发生晚期凋亡，两者联合应用能够增加晚期凋亡细胞的比例，从而体现联用优势。通过 Hoechst 染色也发现 GAL 与 DDP 联用比单独使用产生了更多的分叶状和碎片状核，符合细胞凋亡特征，从而进一步证明了联用更容易促进 HeLa 细胞凋亡。虽然Annexin V-FITC/PI 染色后的流式细胞检测结果与 Hoechst 染色结果存在较大差异，但是通过对晚期细胞凋亡率的分析发现，Hoechst 染色观察到的细胞凋亡率与流式细胞仪检测到的晚期凋亡率一致。这说明 DDP 诱导的早期细胞凋亡在通过 Hoechst 染色观察的细胞形态上尚未发生显著变化。

为了更深入确定GAL 与 DDP 联合促进细胞凋亡的作用优于单独使用。我们通过 Western blot 实验研究了 GAL 与 DDP 协同促凋亡作用的机制。众所周知，caspase-3是细胞凋亡的关键节点，负责各种蛋白质的水解切割，是细胞凋亡必不可少的最终执行者[19]。C-caspase-3（caspase-3 的活性形式）是促进细胞凋亡的主要裂解酶[20]。在细胞凋亡过程中，PARP 被 caspase-3 割成两个片段，导致蛋白质失活[21]。我们研究发现，GAL 与 DDP 联合能够升高 C-caspase-3 和C-PARP 表达水平，而且高剂量联合（GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L）还能降低 caspase-3 表达水平。这进一步确证了 GAL 与 DDP 联合能够通过 caspase-3-PARP 通路诱导 HeLa 细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

总之，尽管 GAL 与 DDP 单独使用都能诱导 HeLa 细胞凋亡，但 DDP侧重于诱导 HeLa 细胞发生早期凋亡，GAL 侧重于 HeLa 细胞发生晚期凋亡，联合应用能够发挥两者在诱导肿瘤细胞凋亡方面的优势，既可以降低单药剂量，又可以协同促进肿瘤细胞凋亡，有望成为宫颈癌患者的更优治疗选择。

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Gambogic acid lysinate enhances the anti-tumor effect of cisplatin by inducing the apoptosis of cervical cancer HeLa cells

NIU Jie, LIU Pu, ZHANG Xin, GUO Jun, WEI Jie, LIN Ya-jun

Author Affiliation: The Fifth School of Clinical Medicine, Peking University, Beijing 100730, China (NIU Jie, LIN Ya-jun); The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing Hospital/National Center of Gerontology of National Health Commission, Beijing 100730, China (LIU Pu, ZHANG Xin, GUO Jun, WEI Jie, LIN Ya-jun)

To explore the mechanism of gambogic acid lysinate (GAL) enhancing the inhibitory effect of cisplatin (DDP) on the proliferation of human cervical cancer HeLa cells.The plate clone formation experiment was used to determine the inhibitory effect of GAL on HeLa cell proliferation. HeLa cells were treated with different concentrations of DDP and/or GAL, and the cell proliferation inhibitory effect was detected by MTT method. The percentage of apoptotic cells was detected by flow cytometry. The apoptotic morphological changes of HeLa cells were observed by Hoechst staining; and the expression levels of apoptosis-related molecules such as caspase-3, cleaved-caspase-3, PARP, and cleaved-PARP were detected by Western blot.GAL treatment is found to inhibit HeLa cell clone formation in a concentration-dependent manner. Both GAL and DDP treatment are found to inhibit the proliferation of HeLa cells in a concentration-dependent manner, and GAL treatment can significantly increase the cell apoptosis induced by DDP, from (56.9 ± 7.78)% to (74.4 ± 9.53)%. Hoechst staining demonstrated that,compared with the control group, the apoptotic cells with nuclear concentration and nuclear edge set were significantly increased, and lobulated and fragmented nuclei were appeared in the GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L combination group. In addition, compared with the control group, the expression levels of cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP were increased in the GAL 0.5 μmol/L + DDP 5 μmol/L group, GAL 1.0 μmol/L group, DDP 10 μmol/L group, and GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L group(< 0.05), while the expression level of caspase-3 was decreased in the GAL 1.0 μmol/L + DDP 10 μmol/L group (< 0.05).GAL enhances the anti-tumor effect of DDP by increasing the apoptosis of HeLa cells induced by DDP. GAL can be used as an enhancer of DDP-induced HeLa cell apoptosis.

gambogic acid lysinate; cisplatin; cervical cancer; apoptosis

LIN Ya-jun, Email: linyajun2000@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.04.006

国家自然科学基金面上项目（81671391）

林雅军，Email：linyajun2000@126.com

2022-02-28