贵州省桑植臭蛙及其系统发育分析

穆 浪 沈 拓 刘 京 李仕泽 粟海军*

(1.贵州大学林学院，贵阳，550025；2.贵州大学生物多样性与自然保护研究中心，贵阳，550025；3.茅台学院资源环境系，仁怀，564500)

臭蛙属(Odorrana)物种广泛分布于日本、中国南部和印度支那，西至印度东北部，缅甸和泰国，南至马来半岛和苏门答腊以及婆罗洲[1]。目前国内报道有臭蛙属物种40种[2-3]，贵州报道有分布的臭蛙属物种14种，即合江臭蛙(O.hejiangensis)、大绿臭蛙(O.graminea)、绿臭蛙(O.margaretae)、黄岗臭蛙(O.huanggangensis)、宜章臭蛙(O.yizhangensis)、花臭蛙(O.schmackeri)、务川臭蛙(O.wuchuanensis)、贵州臭蛙(O.kweichowensis)、荔波臭蛙(O.liboensis)、无指盘臭蛙(O.grahami)、竹叶蛙(O.versabilis)、云南臭蛙(O.yunnanensis)、龙胜臭蛙(O.lungshengensis)和安龙臭蛙(O.anlungensis)[2-4]。

2021年5月30日，在关岭县开展两栖动物多样性调查期间，于关岭县滴水滩瀑布(25°58′36.951 6＂ N，105°37′0.771 6＂ E)采集到 4号成体臭蛙属物种标本。经形态学和分子系统学比较分析，鉴定为桑植臭蛙(O.sangzhiensis)，为贵州省两栖动物新纪录种。本研究对其形态特征及生态习性进行了描述，初步探讨该种形态特征的地理变异，为臭蛙属物种的生物地理学研究提供新的信息。

1 材料与方法

1.1 材料

4号成体臭蛙标本取肌肉组织样品放于95%乙醇中，标本浸泡在10%福尔马林溶液中，存放在茅台学院生物学标本室。

1.2 形态鉴定与测量

标本的形态鉴定依据标准为《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》[5]；使用游标卡尺(无锡锡工量具有限公司；量程200.0 mm，精度0.1 mm)对关岭臭蛙标本的 15项形态特征进行测量。形态测量依据《中国两栖动物检索及图解》[6]。

1.3 分子鉴定

采用高盐法提取肌肉样品总 DNA[7]。利用PCR扩增并测定线粒体16S rRNA基因部分片段，引物使用16SF(5′-ACGAGCCTAGTGATAGCTGGTT-3′)和16SR(5′-CGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′)[8]。16S rRNA基因PCR扩增条件和步骤参照桑植臭蛙新种文献[9]。PCR扩增完成后，对产物电泳检测，将符合测序要求的产物交生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列上传到GenBank(尚未公开)。

从GenBank下载臭蛙属部分物种以及蛙科(Ranidae)部分物种的16S rRNA基因序列，结合关岭臭蛙序列，进行分子系统发育分析，选用序列详情见表1，其中仙琴蛙(Nidiranadaunchina)和中国林蛙(Ranachensinensis)为外群。将下载的所有16S rRNA基因片段在CLUSTAL_X v1.8[10]中进行比对，系统比对后人工校对，然后采用最大似然法(maximum likelihood，ML)构建系统发育关系。构建ML树前，利用jModeltest v2[11]基于AIC标准选择最适核苷酸替代模型。用MEGA v6.0[12]中的Kimura双参数模型计算表1中臭蛙属物种间的遗传距离。

表1 样品信息和GenBank登录号

2 结果与分析

2.1 形态鉴定与度量

本次采集的4号臭蛙标本(GL20210530001～004)均为雌性，比较了贵州采集的臭蛙标本和文献所列臭蛙属物种的形态鉴定特征，发现本研究采集的标本形态特征与桑植臭蛙模式产地标本相近，体长(84.1±1.7) mm (82.4～85.8 mm，n=4)，其他部位量度见表2。

表2 本文标本及模式标本形态度量

续表2

背部绿色，皮肤粗糙，有数个大小不一的黑斑(图1A)；头顶扁平，头长大于头宽；吻长是头体长的14.61%，吻端钝圆，略突出于下唇；鼻孔略近吻端；鼓膜明显；无背侧褶；掌突2；前臂及手长不到头体长的一半，指尖膨大，指长顺序Ⅰ≤Ⅱ<Ⅳ<Ⅲ；后肢细长，胫跗关节贴体前伸达鼻眼之间；胫长为头体长的56.61%，股长是头体长的49.61%，足长是头体长的54.82%，趾间具蹼；趾长顺序Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ<Ⅴ<Ⅳ；腹部光滑，乳白色，股后方有褐色斑(图1 B)。

图1 关岭桑植臭蛙及其生境

与贵州分布近源种的区别：桑植臭蛙与花臭蛙、黄岗臭蛙、合江臭蛙的区别在于前者头长大于头宽，后者均表现为头长与头宽相近；安龙臭蛙指长顺序为Ⅰ≤Ⅱ<Ⅳ<Ⅲ，桑植臭蛙指长顺序为Ⅱ<Ⅰ≈Ⅳ<Ⅲ；宜章臭蛙雌性体长58.2～71.5 mm，贵州臭蛙雌性体长62.4～81.4 mm，桑植臭蛙雌性体长82.4～92.7 mm；桑植臭蛙鼓膜直径大于第Ⅲ指指盘宽度，龙胜臭蛙鼓膜直径与第Ⅲ指指盘宽度几乎等大[9]。

2.2 分子系统发育与遗传距离

PCR扩增共获得桑植臭蛙线粒体16S rRNA基因序列4条，长度506 bp，T、C、A、G 含量分别为23.6%、25.0%、30.3%、21.2%，A+T含量高于G+C含量。最适核苷酸替代模型为GTR+G+I。ML树显示关岭县所采集的标本与桑植臭蛙模式标本聚为一支，支持率为100%(图2)。基于Kimura双参数模型估算的臭蛙属部分物种间的遗传距离如表3，本研究采用的臭蛙属物种间的遗传距离为1.4%～10.8%，平均遗传距离为6.8%。关岭县采集的桑植臭蛙与模式标本间遗传距离为0(表3)。因此，结合形态比较、系统发育分析和遗传距离分析，确定关岭县滴水滩采集的臭蛙标本为桑植臭蛙。

图2 基于线粒体16S rRNA基因联合序列构建的臭蛙属最大似然系统发育树

表3 基于 16S rRNA基因联合序列估算的臭蛙属部分物种间Kimura双参数遗传距离

2.3 生境描述

关岭桑植臭蛙生活于关岭县滴水滩瀑布下的河沟内。采集地海拔约730 m，河沟内有多处裸露的岩石，河道两侧具乔灌丛，河岸多为凹凸不平具有一定倾斜度的石壁(图1C)，与其同域分布的两栖动物仅发现黑眶蟾蜍(Duttaphrynusmelanostictus)。

3 讨论

桑植臭蛙的模式产地为湖南桑植，此前仅在该蛙的模式产地有分布记录。本研究基于形态比较、分子系统发育和遗传距离分析确定该物种在贵州关岭县滴水滩也有分布。虽然关岭县桑植臭蛙种群与模式产地种群形态上存在差异，如与桑植种群相比，关岭种群背部褐色斑点明显较大；关岭种群胫跗关节贴体前伸达鼻眼之间，而桑植种群超过吻端，但系统发育显示两个种群聚为一支，遗传距离分析也显示这两个种群间的遗传距离为0，说明两个种群间尚未发生遗传分化，形态上出现的分化可能和种群间的生境差异有关。关岭县地处乌蒙山系，桑植地处武陵山系，两者间有乌江、北盘江等大江大河相隔，遗传上未发现分化，但在形态上出现了一些分化，是否由长期的地理隔离造成，或因两个产地的标本数量非常有限造成认识的局限，使两者在形态上本不一定出现分化等，这些问题都还有待进一步研究证实。