氮添加对樟子松人工林氮转化及相关功能基因丰度的影响

刘鑫军， 魏洪杰

( 1. 河北政法职业学院 生态工程系， 石家庄 050061； 2. 石家庄市城市水系园林中心， 石家庄 050061 )

土壤氮(N)的有效性是影响陆地生态系统中植物生长和土壤生物化学的重要因素(巨晓棠，2014)。全球N沉降正在改变土壤N有效性及影响着生态系统土壤的N循环(廖珂等，2021；吴玉凤等，2019)，包括N矿化、硝化以及NO排放，这可能导致陆地N供需失衡、面源污染以及温室气体排放等环境问题(李海霞等，2021)。土壤微生物作用被认为是影响N循环过程的主要驱动力，但关于N循环的微生物作用核心过程对N沉降的响应以及与N转化的关系少有报道。

氮功能基因(nitrogen function genes，NFGs)可直接编码关键酶从而影响氮循环过程，是表征氮生物转化功能的直接指标(廖李容等，2019)。以往关于NFGs的研究主要集中于农业生态系统和亚热带森林系统。在农业生态系统中，研究发现施氮对N固定基因()丰度没有显著影响，但增加了硝化基因()和反硝化基因(、、)的相对丰度，其主要受氮形态和土壤pH调控(Ouyang et al., 2018)。而在亚热带森林土壤中，N添加降低了等N固定基因和等反硝化基因丰度，而增加了反硝化基因丰度(Tian et al., 2019)。与亚热带森林和农业土壤相比，北方寒温带森林土壤养分相对贫乏、氮输入低、降水量少以及温度波动较大(Tian et al., 2019)，因此可能形成不同的微生物群落结构从而对氮转化的影响存在差异。然而，目前关于氮添加对寒温带森林土壤NFGs的影响却鲜有报道。

近几十年来，国内外学者在森林生态系统氮的转化方面进行了一系列研究，初步揭示了氮添加情况下非生物和生物因素对特定氮转化过程(即硝化、矿化和NO排放)的驱动机制(Chelsea et al., 2016)。在所有的NFGs中，影响硝化限速步骤的基因、影响反硝化第一步的基因以及影响限速步骤的基因通常被认为是控制N转化的枢纽因子(Ouyang et al., 2018；Chelsea et al., 2016)，且发现土壤有效磷、pH以及溶解性氮是影响NFGs丰度的主要因素，这表明土壤性质和微生物功能在氮素转化中起着重要作用，即外源氮添加可直接影响土壤性质、微生物群落结构，并对氮转化过程产生深远影响(Wang et al., 2017)。但二者在多大程度上作用于氮素转化过程，以及影响氮素转化的主导因素尚不清楚。因此，N添加能否介导土壤NFGs表达，从而影响相关N转化过程?土壤N转化过程与NFGs、土壤性质三者间的相关关系如何?这些问题都严重制约着人们对樟树人工林土壤氮转化及其影响作用机制的认识。本研究以河北省塞罕坝樟子松人造林为研究对象，采用功能基因微阵GeoChip 5.0系统及室内土壤培养法，通过分析不同氮添加水平对土壤性质、NFGs及其氮转化过程参数的影响，拟探讨不同氮添加水平条件下NFGs和土壤性质对樟子松人工林氮素转化的相对贡献以及影响相关氮素转化过程的关键因素，以期为樟子松人工林的氮肥管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区地处大兴安岭山系与冀北山地交汇处，位于河北省围场满族蒙古族自治县北部的塞罕坝机械林场千层板林场内(17°39′42″ E、42°35′45″ N)。该林场于1962年建成，人工林面积20 029.8 hm，是我国樟子松种群的主要人造林区，林分密度1 300～1 600株，该人工林自建成以来每8—10年进行一次采伐及补种。该区域属温带大陆性半干旱半湿润气候区，全年气候冬季漫长，低温寒冷，春秋季短暂，干燥多风，该区域的平均环境氮沉降水平为3.34 g N·m·a。试验区海拔高度为1 432 m，年均降水量为454.2 mm，年均日照时数为2 368.8 h，年均蒸发量为1 244.9 mm，年均相对湿度为75.3%，年均气温为-1.4 ℃。土壤类型主要为风沙土，主要成土母质为风积物、残积物、堆积物。林下灌木、草本稀疏，以瓣蕊唐松草()、腺毛委陵菜()、地榆()、大披针薹草()为主。

1.2 样地设置与样品采集

2018年3月选择树苗年限为12年的样点，设置4个氮素处理，每个处理4个重复，共16个小区，小区面积均为6 m×6 m，小区之间设置4 m的缓冲带。氮素以硝酸铵(NHNO)溶液的形式在四个氮水平下添加：0(N0)，1(N1)，5(N5)和10(N10) g N·m·a，与该地的自然氮沉降速率(3.34 g N·m·a)相比，N1，N5和N10处理分别代表了低、中和高氮沉降量。每次施用将对应NHNO稀释于10 L蒸馏水中，在2018年6月至2020年6月隔两个月施氮一次，施用时间均为月初约早上10:30，并保证该施用时间前后15 h无下雨情况，试验期间共施12次。对于N0处理，采用等体积的蒸馏水喷洒样地，施用时间及方式与氮素添加处理相同。

2020年6月20日(晴天)，使用不锈钢土壤螺旋钻(长20 cm，直径6 cm)从表土(0～20 cm)收集土壤样本，取样前去除表层凋落物，在每个样地随机选取5个取土点土壤汇集成一个样本，保存于无菌聚乙烯袋中，将样品快速储存含干冰的泡沫箱，并快速运送到实验室。所有土壤样本去除残根、凋落物和砾石后分为3部分：第一部分保存于4 ℃，用于测定微生物生物量和溶解营养物以及培养实验；第二部分样品风干后进行土壤基础理化分析；第三部分立即保存于-80 ℃环境采用功能基因微阵GeoChip 5.0系统定量分析土壤NFGs相对丰度。

1.3 样品分析

1.3.1 土壤样品理化性质测定 土壤样品理化性质测定参照鲍士旦(2000)所述测定。土壤pH值测定：称取10.00 g风干土壤于50 mL烧杯中，加入蒸馏水(水∶土=2.5∶1)，间歇搅拌30 min，静置15 min后采用奥豪斯ST3100/F型pH计进行酸碱值测定。土壤有机碳(soil organic carbon，SOC)测定：称取过0.149 mm筛孔的风干土0.500 0 g放入150 mL三角瓶中，加入粉末状AgNO0.10 g，精确加入0.8 mol·L重铬酸钾(KCrO)溶液和浓硫酸各5 mL，瓶口加盖小漏斗，置于230 ℃电砂浴中加热15 min，采用0.1 mol·L的硫酸亚铁溶液还原滴定法测定SOC含量。总氮(total nitrogen，TN)测定：称取0.500 0 g风干土壤放入凯氏瓶中，加入适量蒸馏水湿润样品，加入8 mL浓硫酸，在通风橱中消解至淡蓝色，采用全自动凯氏定氮仪(KDN-520，杭州绿博仪器有限公司)测定。全磷(TP)测定：称取0.25 g风干土壤于镍坩埚，加入3滴无水乙醇，在样品上平铺2 g NaOH，将坩埚放入高温电炉400 ℃、15 min，采用75 ℃蒸馏水洗涤坩埚并转移至100 mL容量瓶中，吸取消化的母液5 mL至50 mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释至30 mL，加入二硝基酚3滴，加入钼锑抗显色剂5 mL，定容至刻度，采用紫外分光光度计(T-6M，上海菲勒仪器有限公司)在700 nm处测定。有效磷(available phosphorus，AP)的测定：称取0.25 g风干土样于200 mL带瓶盖的塑料瓶中，加入50 mL的0.5 mol·LNaHCO，恒温(25 ℃)振荡浸提30 min，采用无磷滤纸过滤，吸取滤液5 mL并加入钼酸铵使用液5 mL和氯化亚锡试剂1滴，显色15 min后借助紫外分光光度计在680 nm处测定。土壤铵态氮(NH-N)和硝态氮(NO-N)测定：称取5.00 g风干土放入离心管中，加入25 mL、2 mol·L的KCl振荡浸提(120 r·min、2 h)，振荡结束后高速离心8 000 r·min、15 min，静置后过滤，取两份滤液，一份加入盐酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液用于测定NO-N，另一份加入苯酚钠-乙二胺四乙酸二钠缓冲液用于测定NH-N，二者皆采用连续流动分析仪(SmartChem 200，AMS/Alliance, Italy)测定。溶解性有机碳(dissolved organic carbon，DOC)测定：称取20.0 g风干土样于带盖的150 mL塑料瓶中，加入60 mL、5 g·L偏磷酸钠，以转速为120 r·min往复振荡18 h，振荡悬浮物放置于60 ℃环境下烘干48 h，借助TOC自动分析仪(TOC-LCPH，Shimadzu，Japan)测定DOC。总溶解性氮(total dissolved nitrogen，TDN)测定：称取5.00 g风干土于50 mL带盖的塑料瓶中，加入25 mL、1 mol·L氯化钾溶液，以转速为180 r·min，往复振荡1 h，振荡悬浮物静置10 min后过滤于50 mL容量瓶中，取8 mL滤液加入10 mL过硫酸钾氧化剂氧化15 min，采用连续流动自动分析仪测定TDN浓度。溶解性有机氮(dissolved organic nitrogen，DON)以TDN — (NH-N + NO-N)计算(吉恒宽等，2020)。称取40%田间持水量的新鲜土壤70.0 g于80 mL的烧杯中，将烧杯放入真空干燥器中，同时放入装满氯仿的同规格烧杯，采用熏蒸抽真空装置抽为真空状态，在-0.07 MPa真空下使氯仿剧烈沸腾5 min，重复该步骤直至氯仿熏蒸完全；将熏蒸土壤转移至塑料瓶中，加入100 mL、0.5 mol·L硫酸钾溶液振荡(25 ℃、300 r·min)浸提30 min，悬浮物过滤，取两份10 mL滤液，一份加入10 mL六偏磷酸钠溶液用于测定微生物生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)，另一份置于消煮管中，加入5 mL浓硫酸消化，回流3 h，用于测定微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)，二者均采用TOC自动分析仪测定。

1.3.2 土壤净氮转化和NO排放速率测定 净氮转化分为净氮硝化速率()和净氮矿化速率()，皆通过培养14 d的土壤样品测定。简而言之，每个样本采用40.00 g土壤置于500 mL的聚乙烯瓶(高8 cm，直径6 cm)中，保持60%的土壤含水率，在25 ℃的恒温黑暗培养箱中预培养6 d，之后在相同的环境条件下正式培养14 d。在培养的第1、第7、第14 d分别对培养瓶进行土壤取样，测定样品无机氮浓度。和(mg N kg·d)计算参照王子龙(2021)的方法，(mg N kg·d)=培养后硝态氮(NO-N)含量 - 培养前硝态氮(NO-N)含量/培养时间。(mg N kg·d)=培养后无机氮(NH-N + NO-N)含量-培养前无机氮(NH-N + NO-N)含量/培养时间。

通过平行培养实验测定NO排放速率。所有的聚乙烯瓶都覆盖一层无菌透气的有机膜，以防止水分流失和保持通气。使用Picarro G2508型气体浓度分析仪(Picarro G2208 Environment, Picarro Inc., CA, USA)在培养期的第1、第3、第5、第7和第14天测定NO排放速率(马芬等，2015)。在测量NO排放速率前密封乙烯培养罐12 h，NO 排放速率(μg·kg·d)通过12 h密闭期中NO浓度的变化计算。

1.3.3 土壤微生物NFGs功能基因测定 利用GeoChip 5.0功能微阵列系统对微生物NFGs的综合序列进行测定分析，该系统是一个分析微生物群落功能基因的高通量平台。GeoChip 5.0包含N57000个寡核苷酸探针，覆盖了N373基因家族中144 000多个基因序列，可以检测比qPCR更广泛的基因类型，现已用于不同的微生物功能和生物地球化学过程(卢慧等，2018)。

将每个处理的土壤样品解冻后，称取0.50 g土壤样本中使用PowerSoil试剂盒(MoBio,Carlsbad,USA)进行DNA提取。各样点土壤取3组平行样品。DNA纯度和数量分别使用分光光度计和截面读取系统(FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech, Jena, Germany)检测。将检测合格的DNA样品进行荧光标记、芯片杂交、芯片扫描与成像(Li et al., 2017)。基因芯片实验每组皆进行3个重复。

基因芯片具体步骤如下，采用Cy-3荧光染料随机引物标记，采用QIA纯化试剂盒(QIAGEN QUICK Purification Kit, Roche NimbleGen Inc, USA)纯化荧光标记后的DNA，并将标记成功的DNA样品采用干燥旋转仪(Savant SVC200, Thermo Savant, Holbrook, NY, USA)在45 ℃条件下干燥45 min。接着在标记浓缩后的DNA样品加入120 μL杂交缓冲液(40%甲酰胺、0.1%十二烷基硫酸钠、10 μg未标记的DNA、2×SSC)，待完全溶解后90 ℃变性5 min，50 ℃保存30 min，在MAUI杂交平台40 ℃进行杂交16 h。采用NimbleGen MS200微阵列扫描仪(Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI, USA)对杂交后的芯片在633 nm上扫描微阵列。扫描得到的图像由Imagene 6.0软件对扫描图像进行转换、提取及信号强度标准化。

数据的标准化处理包括片间归一化和去假阳性。把各个样本光强总和调整为同一批次光强最高样本水平。去除信噪比小于2.0的低质量点。将信号值标准化，最后转化为自然对数数字信息(Zhang et al., 2017)。上述NFGs功能基因分析委托上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 氮添加对樟子松人工林土壤理化性质的影响

从图1可知，连续两年的N添加显著改变了部分土壤的理化性质。从单个土壤指标来看，土壤NO-N和DON浓度随着N添加水平的增加而增加，皆以N10处理值最大，且显著大于N0处理(<0.05)。随着氮添加水平的提高土壤NH-N含量呈下降趋势，但各处理间均无显著差异。SOC、MBC以及C/N随着N添加水平的增加呈先上升后下降的趋势，同时皆表现为N5处理具有最大值；DOC含量随着N添加水平的提高亦呈降低趋势，以N1处理值最大。其他土壤性质中，各处理的MBN、TN、TP、AP和pH差距较小，处理间皆均无显著差异。

不同小写字母表示不同处理间有显著性差异(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05). The same below. 图 1 氮添加对樟子松人工林土壤理化性质的影响Fig. 1 Effects of nitrogen addition on soil physical and chemical properties of Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.2 氮添加对樟子松人工林氮功能基因(NFGs)相对丰度的影响

从图2可知，N的添加显著改变了部分NFGs的相对丰度。就单个NFG基因的相对丰度来看，N养分固定基因()和反硝化基因()是NFGs丰度值最大的两个基因，分别占总丰度的16.69%～18.03%和17.42%～18.98%。同时，较未施氮处理(N0)相比，N1处理显著增加了参与硝化过程的-和-基因(编码单氧化铵酶)、参与反硝化作用的基因(编码亚硝酸还原酶)、参与同化氮还原的基因(编码硝酸还原酶)、参与异化氮还原的基因(编码硝酸还原酶辅酶Ⅱ)的相对丰度；N5处理显著增加了参与氨化的基因(编码脲酶)、-、、以及的相对丰度。同样，N10处理中，除了参与氨氧化物的基因(编码谷氨酸合酶)与其他处理无显著差异外，其余NFGs的相对丰度皆显著下降。

图 2 氮添加对樟子松人工林氮功能基因(NFGs)相对丰度的影响 Fig. 2 Effects of nitrogen addition on the relative abundance of nitrogen functional genes (NFGs) in Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.3 氮添加对樟子松人工林氮素转化过程NFGs总丰度的影响

由图3可知，就各氮素转化过程的NFGs总相对丰度来看，微生物对氮素反硝化、固氮、氨化的过程影响最大，三者丰度总和占总NFGs丰度的73.7%以上。从试验处理丰度值来看，在反硝化、固氮、氨化、厌氧氨氧化、硝化、同化氮还原及异化氮还原7个氮素转化过程中，除厌氧氨氧化的N10与N0无显著差异外，其他各过程皆以N10处理显著小于其他处理，且各处理氮素转化过程呈N5>N1>N0>N10的趋势，且N0与N1之间均无显著差异。

图 3 氮添加对樟子松人工林各氮转化过程NFGs相对丰度的影响 Fig. 3 Effects of nitrogen addition on the relative abundance of NFGs in each nitrogen transformation process of Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.4 氮添加对樟子松人工林 土壤净N硝化速率、净N矿化和N2O排放速率的影响

由表1可知，与N0处理相比，两年的氮添加显著增加了N1和N5净N硝化、净N矿化和NO的排放速率，三者在N5处理时达到最大值，之后在N10处理时下降，N10处理与N0处理均没有显著差异。与N0处理相比，添加氮后净N硝化、矿化和NO的排放速率均有不程度提高，净N硝化率、矿化和NO排放速率在加入氮后分别增加了18.62%～57.41%、10.95%～49.88%和1.69%～28.55%。

表 1 氮添加对樟子松人工林土壤净N硝化速率、净N矿化率和N2O排放速率的影响Table 1 Effects of nitrogen addition on soil net N nitrification rate, net N mineralization rate and N2O emission rate in Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.5 氮添加下樟子松人工林土壤氮转化NFGs丰度与土壤因子的相关分析

从表2可知，12个土壤理化性质指标与固氮、氨化、硝化、反硝化等7个氮素转化指标的相关分析中，土壤因子TN、TP、NO-N、DOC中与某一氮转化过程NFGs丰度存在显著相关性，其余土壤因子与其任一氮转化过程NFGs丰度均无显著相关性。就TN而言，TN与硝化、同化氮还原、异化氮还原过程指标均呈显著正相关。TP与异化氮还原NFGs丰度呈显著正相关。在NO-N与DOC的土壤指标中，DOC与固氮、氨化、反硝化、同化氮还原、异化氮还原呈显著正相关，NO-N与固氮、氨化、硝化、反硝化、同化氮还原、异化氮还原、厌氧氨氧化的NFGs丰度皆呈显著正相关。

2.6 土壤净N硝化速率、净N矿化和N2O排放速率与NFGs、土壤性质的相关分析

由表3可见，相关系数表明净氮硝化速率()、净氮矿化率()和NO排放速率()与部分NFGs的相对丰度和土壤性质指标密切相关。整体来看，与、-、、的相对丰度以及土壤SOC、NO-N、MBC、MBC含量呈显著正相关，其中MBC和SOC与的相关性较强。净氮矿化率()与参与氮循环过程的NFGs，如、、、-、、、、、以及土壤SOC、MBC含量呈显著正相关，但与MBC含量和的相关性比与其他因素的相关性更密切。与除和基因无明显相关关系外，与其他所有硝化和反硝化基因相对丰度均呈极显著相关，与土壤SOC、MBC含量呈极显著正相关，其中-、与更密切。

2.7 土壤净氮转化和N2O排放速率与NFGs、土壤性质的回归分析

由表4可见，基于逐步多元回归分析表明，-相对丰度和土壤MBC含量是影响净N硝化速率()的主导因子，回归分析的决定系数()值为0.64(<0.001)。、相对丰度和土壤MBC含量是影响净N矿化率()的主导因子，回归分析的值为0.75(<0.001)；相对丰度和相对丰度是影响NO排放速率()的主导因子，回归分析的值为0.69(<0.001)。

3 讨论

适量的氮(N)添加可以缓解生态系统中的氮素限制，为微生物的生长和基础代谢提供底物和能量，从而激发土壤养分有效性、提高微生物的功能活性(Li et al., 2017)。本研究地点位于塞罕坝人工林场，该区域已被证实氮储备较低(任艳林，2012)，因此N添加可能对该区域的养分底物有效性产生影响。本研究中，不同氮水平对不同指标影响不一，随着氮素添加水平的提高，土壤SOC、MBC、DOC则呈先上升后下降的趋势，当土壤由于过量添加N而使土壤N饱和时，土壤养分的分配可能会因此受到影响而降低，即N添加水平存在一定阈值。在为期2年的试验中，各处理的土壤pH为7.62～7.76，处理间无明显差异，且与NFGs的相对丰度没有表现出显著的相关性，说明本研究中土壤pH对NFGs影响较弱。这可能是由于土壤具有较高的缓冲能力(江军等，2019)或与其他微生物的共同作用(例如丛枝菌根菌丝作用)的结果(曹本福等，2021)；此外，在TN、TP、AP、MBN中各处理亦无明显差异，这可能是因为2年的氮添加试验时间较短，不能对其土壤肥力产生全面质变影响的缘故(Ouyang et al., 2016)。

在本研究中，基于GeoChip 5.0微阵列系统探索了参与氮转化过程关键基因的相对丰度，结果表明：中低N添加处理(N1、N5)对所有NFGs皆表现出一定的促进作用，尤其体现在氨化、硝化和反硝化相关基因，而高N添加(N10)显著降低了所有NFGs的相对丰度。

在氨化循环的相关基因中，N1和N5处理中的相对丰度显著增加，同时在N5处理达到峰值，在N10显著下降，且谷氨酰胺合成基因()和厌氧氨氧化基因()丰度保持不变，这反映了氮素在达到饱和临界状态从而向矿化转化的趋势(Zhang et al., 2019)。此外，本研究发现在N1和N5处理下的没有明显增加，这与前人的研究结果一致，即施氮对的相对丰度没有影响(Berthrong et al., 2014)。这可能是由于在环境中获得的N为有效态(NH-N、NO-N)，因此不需要额外的能量代谢投入(Zheng et al.,2017)。

在参与硝化过程的相关基因中，氮添加处理(N1、N5)显著增加了-和-的相对丰度，这与Szukics(2012)在温带森林中的研究结果趋于一致，这意味着区域气候影响不是主导硝化作用的主要驱动因子。此外，本研究发现硝化过程的总基因丰度与土壤TN、NO-N呈显著正相关(表2)，表明N添加引起的土壤N含量增加可提高硝化基因丰度。值得注意的是，在所有处理中-的丰度皆明显高于-。前人研究表明-受具有核糖体的功能微生物所介导，因此在营养丰富的环境或适量增加N情况下其相对丰度较高。而-与铵具有较高的亲和力，对氮限制或氮饱和环境具有更好的耐受性(Ouyang et al., 2019)。因此，研究区域中-在丰度数值上比-更大， 同时-对N的增加反应更敏感，这与农业土壤中的观测结果相似(宋延静等，2020)。

表 4 NFGs、土壤因子与净N硝化速率，净N矿化率和N2O排放速率的逐步多元回归分析Table 4 Stepwise multiple regression analysis of NFGs, soil factor and net N nitrification rate, net N mineralization rate and N2O emission rate

在反硝化的相关功能基因中，N1和N5处理显著增加了的相对丰度，但其他反硝化基因的相对丰度几乎不变，本研究结果与前人在森林系统中得到的研究结果不同。前人研究表明、和丰度随着N添加的增加而大幅度提升，和对N添加不敏感(Tang et al., 2016)。两者研究结果不同的原因可能与反硝化作用的步骤顺序有关，硝酸盐是反硝化的起始底物，其浓度的变化显著影响的表达；随着反硝化的进行，由于植物吸收或N发生气态流失使得硝酸盐浓度降低(刘躲等，2020)，因此可能会弱化N添加对和的影响(Chen et al., 2012)。此外，在本研究中，反硝化基因的相对丰度与NO-N、DOC呈显著正相关，这与Wang等(2017)研究结论的和相对丰度与SOC、NO-N含量呈正相关的结果趋于一致。这可能是参与反硝化作用的微生物大多是异养型，因而更多的依赖于有机物。

土壤氮素转化过程主要表现为硝化、矿化和NO排放，是表征氮素供给及氮损失的重要表征(林伟等，2020)。本研究发现，中、低N添加显著提高了净氮硝化速率()、净氮矿化率()和NO排放速率()，但在高N处理(N10)中上述指标均有所下降。和是反映土壤无机氮库净变化的直接指标，是有机物质分解、矿化、硝化和固定过程相互作用的重要表现(Chen et al., 2012)。本研究发现与相关N转化过程的核心基因显著相关。逐步回归多元分析表明，-的相对丰度和MBC含量是影响的关键因素，且相关性分析表明-与之间具有显著相关性，因此-可能是半干旱人工林生态系统中驱动土壤硝化的主要基因(Zhang et al., 2019；Tang et al., 2019)。此外，逐步回归多元分析显示，、丰度和MBC含量是影响的重要参数，表明与有机氮矿化和反硝化过程密切相关。同理，与参与硝化和反硝化过程的NFGs显著相关，与反硝化途径基因和密切相关，表明反硝化是温带森林土壤中NO释放的主要途径，而、与显著正相关，这意味着丰度可作为估算Re排放的有效参数(Flaa et al., 2019)。

4 结论

本研究表明，中、低氮添加水平(1、5 g N·m·a)对氮功能基因(NFGs)的总相对丰度没有显著影响，但增加了氨化、硝化和反硝化等特定基因的相对丰度。高N添加处理(N10)中，所有氮转化过程的NFGs相对丰度皆显著降低。这些影响主要与土壤C、N养分指标(SOC、NO-N、DON)的变化有关，而与pH无关。相关分析表明，上述促进作用与土壤SOC、NO-N和MBC显著相关。N10处理显著降低了所有氮转化过程NFGs的相对丰度，这种负面影响与DOC、MBC含量的减少有关。与氮转化基因丰度规律趋势相似，N1和N5处理显著增加了净N硝化、净N矿化以及NO的排放速率，但N10促进作用不明显，表明氮添加对氮转化的促进作用存在阈值。此外，逐步多元回归分析表明，-的相对丰度和MBC含量可作为净N硝化率的关键预测指标；、的相对丰度与MBC含量可作为净氮矿化率的关键预测指标；而、的相对丰度可作为NO排放速率的关键预测指标。本研究结果为樟子松人工林的氮肥管理提供了理论依据。