快速鉴定紫花苜蓿混入苜蓿菟丝子的分子方法及其通用性

吴昱果，周 强，贾程琳，刘志鹏

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 /

兰州大学草地农业科技学院, 甘肃 兰州 730020）

自然界中，同一属内的牧草种子，甚至不同属间的种子，在颜色、形状、大小和重量上有很多相似之处，但每种牧草都有自己独特的生命周期和农业用途，因此高纯度的牧草种子是品质和产量的重要保障[1-2]。然而，由于遗传特性和生长环境(气候和土壤等)的影响，一些植物种子在大小、形状和颜色上都具有相似性[3-4]。因此，当这些相似的种子混合在一起时，很难区分开来。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生豆科草本植物，具有营养丰富、产量高和适口性好等特点，作为首选饲料作物，在全球范围广泛种植[5-6]。近年来，随着我国苜蓿种植面积的逐步扩大，苜蓿杂草问题已成为制约苜蓿产业发展的重要因素之一[7-8]。紫花苜蓿种子中常混有苜蓿菟丝子(Cuscuta approximata)种子，有研究表明在我国新疆塔城地区，紫花苜蓿种子中菟丝子种子的含量高达13.4%，菟丝子种子已严重危害紫花苜蓿的种子生产[9]。由于菟丝子种子和紫花苜蓿种子在形态上较为相似、种子细小[7]，一旦紫花苜蓿中混有苜蓿菟丝子种子，难以鉴定和清除，给紫花苜蓿的生产带来重大损失，并对当地生态系统造成不可逆的恶性破坏[9]。此外，由于菟丝子属植物恶性寄生的生物特性，我国海关已将菟丝子列为检疫性杂草，但从进口紫花苜蓿种子中快速鉴别是否混入菟丝子种子仍较为困难[10]。因此，亟需一种准确、快速、低成本的鉴定方法来区分紫花苜蓿种子和菟丝子种子。

截至目前，相似种子常用的鉴定方法是形态比较[11-12]、简单重复序列标记(simple sequence repeat,SSR)分子标记[13]和多光谱影像[14]，但形态比较法需要经验丰富的鉴定人员重复观察，耗时长且不可靠；SSR 分子标记法虽然准确，但试验设计复杂；多光谱影像法则需要特定的多光谱成像系统。因此，本研究利用分子实验室常用的仪器和操作技术，对8 份紫花苜蓿种质和3 份不同来源的苜蓿菟丝子种子进行鉴定；根据菟丝子和紫花苜蓿rbcL基因的序列差异，针对菟丝子设计特有引物，利用聚合酶链反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术，以期开发一种快速、准确的分子方法。为牧草种子生产和海关检疫提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

如表1 所列，本研究通过8 份紫花苜蓿种质和3 份不同来源的苜蓿菟丝子，每份材料随机挑选20 粒种子，进行后续种子DNA 提取。

表1 紫花苜蓿和苜蓿菟丝子种质资源信息Table 1 Germplasm accessions of Medicago sativa and Cuscuta approximata used in this study

1.2 试验方法

1.2.1 种子形态特征测定

每个种质中随机选择15 粒种子，利用体式显微镜(Leica, M205)观察紫花苜蓿种子和苜蓿菟丝子种子的形态。通过Digimizer 软件(MedCalc Software,Belgium)测定种子长度、宽度、周长和面积4 个形态学指标，进行形态学比较[15]。

1.2.2 种子DNA 提取

分别从8 个紫花苜蓿种质和3 个不同来源苜蓿菟丝子中随机选取20 粒种子，通过CTAB 法进行基因组DNA 的提取[16]。苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子的DNA 按照1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500 和1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000 的比例混合后，备用。此外，将苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子粒数分别按照1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500 和1 ∶ 1 000 的比例混合，研磨后，进行DNA 提取和PCR 扩增。

1.2.3 引物设计

根据苜蓿菟丝子和紫花苜蓿rbcL基因的序列差异，针对苜蓿菟丝子设计特异性引物(图1)。rbcL基因是植物叶绿体基因组中相对保守的基因，已成功用于种间和属内种间系统关系的研究[17-18]，扩增产物稳定，提高鉴定结果的可靠性。该引物的序列为Cuscuta-F，5′-CGAAGATCTTCGAATACCTCCA-3′；Cuscuta-R，5′-ATCAATAACTGCATGCATTGCG-3′。

图1 紫花苜蓿和苜蓿菟丝子叶绿体DNA 部分rbcL 基因区域的序列比对Figure 1 Sequence alignments of a portion of the rbcL regions of alfalfa and dodder chloroplast DNA

1.2.4 PCR 扩增

利用苜蓿菟丝子的特异引物，对上述种子基因组DNA 进行PCR 检测。PCR 检测体系的总体积为10 μL，其中包括2 × EcoTaq PCR SuperMix (上海 生 工，产 品 编 号：SK2082) 5 μL，引 物Cuscuta-F 和引物Cuscuta-R 各0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，以及上述种子DNA 模板(50 ng·μL-1) 0.5 μL。扩增条件为：

1) 94 ℃预变性3 min；2) 94 ℃变性30 s；3) 57 ℃退火30 s；4) 72 ℃延 伸50 s；5)第2 至第4 步 骤循环33 次；6) 72 ℃ 延伸7 min。而且，苜蓿菟丝子种子和 紫 花 苜 蓿 种 子DNA 分 别 以1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000的比例混合，通过混合后的种子基因组DNA 用作模 板 进 行PCR 扩 增。由 于 以1 ∶ 5000 和1 ∶ 10 000比例混合的DNA 为模板时，扩增苜蓿菟丝子的PCR 产物较少，难以检测到。因此将此次PCR 产物作为混合比例的DNA 模板继续进行二次PCR扩增。

1.2.5 电泳检测

取5 μL PCR 产物在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为135 V，时间为25 min。电泳完成后，用凝胶成像仪照相记录分析。

2 结果与分析

2.1 种子形态特征和菟丝子危害

通过体式显微镜和Digimizer 的软件测量，结果表明紫花苜蓿种子和苜蓿菟丝子种子均细小，在形态上较为相似，如两个物种的种子面积都在1.0 ～2.0 mm2(图2、表2)，通过肉眼难以辨认，进一步增加了植物检疫工作的难度。在生产中，若没有及时发现和清除混在紫花苜蓿中的菟丝子种子，将给紫花苜蓿产量带来重大损失，并对当地生态系统造成不可逆的恶性破坏(图3)。

图2 紫花苜蓿和苜蓿菟丝子种子Figure 2 Seeds of Medicago sativa and Cuscuta approximata

图3 寄生在紫花苜蓿上的菟丝子Figure 3 Cuscuta approximata twining around Medicago sativa

表2 8 份紫花苜蓿种质和3 份不同产地苜蓿菟丝子的4 项种子形态指标Table 2 Statistical analyses of four morphological indices between the seeds of eight Medicago sativa accessions and Cuscuta approximata from different habitats

2.2 苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子的电泳结果

根据PCR 产物的电泳图谱，8 份紫花苜蓿种子和3 份苜蓿菟丝子种子材料之间的电泳结果差异明显。针对Cuscuta-F 和Cuscuta-R 引物，紫花苜蓿的DNA 样品无扩增条带，苜蓿菟丝子的DNA 样品在约为500 bp 的位置扩增出条带(图4)。

图4 苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种质间的电泳结果Figure 4 The electrophoresis results obtained for dodder and alfalfa accessions

2.3 苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子混合的电泳结果

此外，还通过按预定比例混合苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子的DNA，进一步证明该引物对的灵敏性和准确性(图5)。在苜蓿菟丝子和紫花苜蓿的DNA比例为1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000 的 水 平 下，用Cuscuta-F 和Cuscuta-R 引 物均能扩增出大小约为500 bp 的条带，且随着菟丝子DNA 浓度的降低，条带亮度也逐渐减弱。在苜蓿菟丝子和紫花苜蓿的DNA 浓度为1 ∶ 5 000 和1 ∶ 10 000的水平下，初次PCR 产物经电泳检测，无条带；但将1 μL 初次PCR 产物作为DNA 模板，再经过扩增后有明亮的条带出现，且条带大小和之前的结果一致。

图5 苜蓿菟丝子种子和紫花苜蓿种子不同比例DNA 混合物的电泳结果Figure 5 The electrophoresis results obtained for mixtures of dodder and alfalfa seed DNA

同时，为进一步验证该方法的可行性，将苜蓿菟丝子和紫花苜蓿按照一定粒数的种子比例混合(图6)。在苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子粒数的比例分别为1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500 和1 ∶ 1 000的水平下，均可以准确检测到混在紫花苜蓿种子中的菟丝子种子。

图6 苜蓿菟丝子和紫花苜蓿不同比例种子粒数混合的电泳结果Figure 6 The electrophoresis results obtained for different numbers of dodder seeds mixed with alfalfa seeds

2.4 鉴定形态相似种子的通用方法

以苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子鉴定方法为基础，初步绘制了形态相似种子鉴定的通用流程图(图7)。首先，在NCBI 上查找相似物种同源基因的序列，根据同源基因的序列差异，设计物种的特异性引物；随后，进行种子DNA 的提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳和照相分析；最终，根据电泳条带的有无，分析结果，完成鉴定。整个流程大约可在5 h 内完成。总之，该方法只需通过5 个关键步骤(序列查找、引物设计、DNA 提取、PCR、凝胶电泳)可快速、准确、灵敏地用于形态相似种子的鉴定。

图7 鉴定种子形态相似牧草的总结流程图Figure 7 A summary flowchart for the discrimination of forage seeds with similar morphologies

3 讨论与结论

高品质种子是优质牧草的重要保障，但随着我国进口紫花苜蓿种子数量的增加[19-20]，寄生紫花苜蓿的菟丝子传入我国的风险越来越大。一旦紫花苜蓿种子中混有菟丝子种子，传统方法难以鉴定，将给紫花苜蓿的生产带来不可挽回的损失。我国现行的《牧草种子检验规程》[21]中常用的测定方法主要有4 种，分别是种子测定、幼苗测定、温室或培养室的植株测定和田间小区植株测定。其中，苜蓿属(Medicago)的种子测定是根据其形态特征；幼苗测定是对幼苗进行形态和化学鉴定，如将切开的根尖或其他细胞在显微镜下进行测定；温室或培养室的植株测定是当植株达到适当的发育阶段时，观察记载每个植株的目标测定性状；田间小区植株测定是记录和观察不同植株全生育期的差异，鉴定工作需延续到整个生育期。因此，建立一种快速、可靠性高、灵敏度高、通用的分子方法用于区分形态相似的牧草种子鉴定，对种子生产和畜牧业具有重要意义。

由于植物的叶绿体DNA 为母性遗传，相对于核基因更保守，因此已被广泛用于分子鉴定、植物条形码分析和植物分子系统进化分析[22-24]。本研究通过比较苜蓿菟丝子和紫花苜蓿叶绿体rbcL基因的序列差异，设计苜蓿菟丝子的特异引物Cuscuta-F和Cuscuta-R，依次进行DNA 提取、PCR 扩增和电泳，最终根据扩增条带的有无，快速、准确地鉴定紫花苜蓿种子中是否混有杂草菟丝子种子，整个过程只需要5 h 左右。

虽然本研究中苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子DNA 比例极低(如1 ∶ 10 000)，仍可通过二次PCR扩增检测到菟丝子种子，即使1 000 粒紫花苜蓿种子中混有1 粒苜蓿菟丝子，也可以准确检测出混杂在紫花苜蓿中的苜蓿菟丝子。因此，该方法可为海关检疫紫花苜蓿种子中是否携带寄生植物菟丝子种子提供便捷的检测技术，大大提高检疫部门对菟丝子检疫的工作效率。然而，该通用方法也存在一些局限性，一些草类植物在NCBI 中尚未有公布的序列，因此无法设计引物。这种情况需要利用传统的鉴定方法，如观察种子形态，以及随机抽样进行种植，在植物幼苗和成熟期进行比较验证。

总之，与现有的其他鉴定方法相比，如传统的形态比较，SSR 分子标记和多光谱影像，鉴定方法费时、耗力或需要特定的多光谱成像系统。本研究建立的通用方法具有明显优势，该方法的高准确性，简便性，可靠性和灵敏性也增加了其在野生牧草种质资源的搜集和育种，以及牧草种子纯度的鉴定和评估等方面具有广阔的应用前景。