饲粮中添加酯化植物甾醇对断奶仔猪生长性能、养分表观消化率、血清生化指标、回肠消化酶活性及肠道免疫指标的影响

卓锐文 陈 罡, 杨凯丽 张 沙 谭 新 方成堃 贺 正 方热军*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南鑫广安农牧股份有限公司，长沙 410199；3.湖南禾益元生物科技有限公司，湘潭 411104)

规模化养殖过程中，环境中的诸多因素，如湿度、温度、细菌、病毒、饲料中的抗营养因子等均会影响仔猪生长发育，因而仔猪会出现消化不良、饲料报酬低下、腹泻等一系列表现，导致生长发育缓慢。抗生素能够预防和治疗疾病、促进动物生长，因此它在维持动物生长性能与保护动物健康上扮演着一个重要的角色。但是，自2020年1月开始，我国开始全面禁用饲用抗生素，故目前寻找一种绿色、安全、无毒的饲料添加剂来替代抗生素保障畜禽生产就显得十分重要。

植物甾醇(phytosterol，PS)是植物油中的一种天然成分，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇菜油甾醇、菜籽甾醇等一类以环戊烷多氢菲为骨架的天然生理活性物质[1]，它作为前体可以合成多种激素、维生素D和甾体化合物。PS与胆固醇结构相似，可以通过竞争吸收位点，抑制肠道对外源性胆固醇的吸收，从而降低血液循环中的胆固醇含量，调节脂质体的通透性与稳定性[2]，并且PS有着抗炎、抗癌、抗氧化等作用，可以预防心血管疾病，被科学家们称为“生命的钥匙”[3-4]。纯化后的PS难溶于水，并具有较低的肠道生物利用度，因此肠道对PS的吸收是一个耗能、耗时、低效的过程。提高PS生物利用度和溶解性的最常用方法是用多不饱和脂肪酸酯化PS，形成酯化植物甾醇(phytosterol ester，PSE)[5-6]，酯化后的PS相对于非酯化型甾醇提高了5倍的吸收率，此外，PS的吸收率受动物性别的影响，例如雌性大鼠的吸收率要优于雄性大鼠[7]。PSE是通过胰胆固醇脂酶水解成为游离型甾醇后被吸收的，这是游离甾醇和酯化型甾醇在代谢上仅有的差别，因此PSE同样具有PS的生理功能[8]。在家禽生产中有报道称，饲粮中添加PS可以降低血浆或产品(鸡蛋、鸡肉)中胆固醇含量[9]，改善禽类肉品质，提高其生长性能和抗氧化能力[10-11]；并且Shi等[12]观察到，长期使用高剂量PS(最高800 mg/kg)不会诱发任何毒理学效应。Kim等[13]研究发现，饲喂3 000 mg/kg的PSE对SD大鼠无毒副作用；Davidson等[14]研究发现，当人体每日PSE的摄取量为9.0 g时，也未见毒副作用。目前，关于PSE在仔猪上的研究鲜见报道。因此，本文以断奶仔猪为对象，研究PSE对其生长性能、养分表观消化率、血清生化指标、回肠消化酶活性及肠道免疫指标的影响，以期为PSE在仔猪生产中的应用提供理论依据，并寻找安全、绿色的“替抗”产品，促进畜牧业健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验采用单因素试验设计，选用平均体重为(6.88±0.49) kg、同一来源、胎次相近、健康状况良好、21日龄断奶的杜×长×大三元杂交仔猪120头，随机分为5组，每组4个重复，每个重复6头仔猪。对照组饲喂基础饲粮，PSE-150组、PSE-300组、PSE-450组、PSE-600组在基础饲粮中分别添加150、300、450、600 mg/kg的PSE。预试期7 d，正试期28 d。基础饲粮组成及营养水平见表1。PSE由某生物科技有限公司提供，有效成分为50%。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目Items含量 Content第1～14天Days 1 to 14第15～28天Days 15 to 28可消化赖氨酸 DLys1.351.24可消化蛋氨酸 DMet0.470.44可消化蛋氨酸+可消化半胱氨酸 DMet+DCys0.740.69可消化苏氨酸 DThr0.770.72可消化色氨酸 DTrp0.220.21

1.2 饲养管理

试验期间，各组饲养管理条件保持一致，所有仔猪均自由采食，自由饮水。每日09：00对猪舍进行清扫，每周对猪舍进行1次喷雾消毒，确保圈舍通风、干燥、卫生。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

仔猪分别于试验第1天和第28天，禁食(自由饮水)12 h后逐头称重，以重复为单位，每日统计耗料量，计算平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F/G)、初重(initial weight)、末重(final weight)、腹泻率(diarrhea rate)。

1.3.2 养分表观消化率

试验结束前3 d，每个重复每天按5点法收集粪样150 g，每100 g加入10 mL 10%硫酸进行固氮，样品保存于-20 ℃冰箱中待测。采用四分法采集饲粮样品200 g，样品保存于4 ℃冰箱中待测。参照《饲料分析与检测》中的方法，测定饲粮样品与粪样中粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、干物质(DM)、有机物(OM)含量及能量，采用酸不溶灰分法(acid insoluble ash，AIA)计算养分表观消化率，具体步骤参照GB/T 23742—2009，计算公式如下：

某养分表观消化率(%)=100-[(粪中该养分
含量×饲粮酸不溶灰分含量)/(饲粮中该养分
含量×粪中酸不溶灰分含量)]×100。

1.3.3 血清生化指标

试验结束时，每个重复随机挑选2头仔猪，每头通过前腔静脉采血10 mL，使用台式低速自动平衡离心机(L500，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，3 000 r/min离心10 min分离血清，-80 ℃保存，采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，使用全自动生化分析仪(BS-420，迈瑞医疗国际股份有限公司)测定血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性及葡萄糖(glucose，GLU)、总蛋白(total protein，TP)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、白蛋白(albumin，ALB)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)、尿素氮(urea nitrogen，UN)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。

1.3.4 回肠消化酶活性

试验结束时，每个重复随机挑选2头仔猪进行屠宰，收集回肠食糜，-80 ℃冷冻保存，采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，使用紫外可见分光光度计(UV752，上海佑科仪器仪表有限公司)测定回肠食糜中α-淀粉酶(α-amylase)、胰蛋白酶(trypsin)、蔗糖酶(sucrase)、脂肪酶(lipase)活性。

1.3.5 回肠黏膜免疫指标

试验结束时，每个重复随机挑选2头仔猪进行屠宰，收集回肠黏膜，-80 ℃保存，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法和酶标分析仪(Rayto RT-6100)检测回肠黏膜中二胺氧化酶(DAO)活性及白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)含量。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行单因素方差分析，若差异显著，则采用Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著，结果采用平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结 果

2.1 饲粮中添加PSE对断奶仔猪生长性能的影响

如表2所示，PSE-450组的平均日采食量显著高于对照组、PSE-150组和PSE-300组(P<0.05)，但与PSE-600组无显著差异(P>0.05)；平均日采食量与PSE添加水平呈显著线性和二次关系(P<0.05)。各组之间断奶仔猪末重、平均日增重、料重比和腹泻率差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，PSE-150组、PSE-300组、PSE-450组和PSE-600组的末重分别提高了3.27%、2.67%、5.68%和3.01%，料重比分别降低了7.22%、7.78%、7.22%和8.33%。

表2 饲粮中添加PSE对断奶仔猪生长性能的影响

2.2 饲粮中添加PSE对断奶仔猪养分表观消化率的影响

如表3所示，PSE-300组的粗蛋白质、干物质、有机物表观消化率及表观消化能显著高于对照组和PSE-150组(P<0.05)，并且PSE-450组和PSE-600组的粗蛋白质、干物质、有机物表观消化率及表观消化能显著高于对照组(P<0.05)。PSE-300组的粗纤维表观消化率显著高于其他各组(P<0.05)。PSE-150组、PSE-300组、PSE-450组和PSE-600组的粗脂肪表观消化率显著高于对照组(P<0.05)。粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、干物质、有机物表观消化率及表观消化能均与PSE添加水平呈显著线性和二次关系(P<0.05)。

2.3 饲粮中添加PSE对断奶仔猪血清生化指标的影响

如表4所示，PSE-150组的血清HDL-C含量显著高于对照组和PSE-600组(P<0.05)，与PSE-300组和PSE-450组无显著差异(P>0.05)。各组之间血清LHD、ALP、AST、ALT活性及GLU、TP、TC、TG、ALB、TBA、UN、LDL-C含量无显著差异(P>0.05)。血清HDL-C、LDL-C含量与PSE添加水平呈显著二次关系(P<0.05)。

2.4 饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠消化酶活性的影响

如表5所示，各组之间回肠胰蛋白酶、蔗糖酶活性无显著差异(P>0.05)。PSE-600组的回肠α-淀粉酶活性显著高于对照组和PSE-150组(P<0.05)，与PSE-300组和PSE-450组无显著差异(P>0.05)；回肠α-淀粉酶活性与PSE添加水平呈显著线性关系(P<0.05)。PSE-450组和PSE-600组的回肠脂肪酶活性显著高于对照组和PSE-150组(P<0.05)；回肠脂肪酶活性与PSE添加水平呈显著线性和二次关系(P<0.05)。

表3 饲粮中添加PSE对断奶仔猪养分表观消化率和表观消化能的影响

表4 饲粮中添加PSE对断奶仔猪血清生化指标的影响

续表4项目Items组别 Groups对照 ControlPSE-150PSE-300PSE-450PSE-600P值 P-value组别Groups线性Linear二次Quadratic甘油三酯 TG/(mmol/L)0.43±0.230.43±0.130.40±0.150.48±0.150.48±0.130.8140.4780.473血清白蛋白 ALB/(g/L)25.92±3.8828.10±3.5826.21±3.1228.46±3.2227.66±2.040.3660.4450.286谷丙转氨酶 ALT/(U/L)62.80±13.4672.19±11.9370.03±7.1367.88±15.4864.31±13.720.7380.7790.183总胆汁酸 TBA/(μmol/L)23.57±2.0125.97±8.9228.52±14.4923.19±1.4724.28±9.330.6230.7940.223尿素氮 UN/(mmol/L)24.66±2.8224.64±3.4326.78±3.8221.43±1.7823.05±4.740.1210.3020.179高密度脂 蛋白胆固醇 HDL-C/(mmol/L)7.42±1.56b11.26±2.97a9.21±1.71ab9.67±1.79ab8.95±1.18b0.0290.3290.011低密度脂 蛋白胆固醇 LDL-C/(mmol/L)1.31±0.351.32±0.151.21±0.081.03±0.151.31±0.240.1260.0940.049

表5 饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠消化酶活性的影响

2.5 饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠黏膜免疫指标的影响

如表6所示，PSE-300组和PSE-450组的回肠黏膜IL-8含量显著低于对照组(P<0.05)，PSE-300组的回肠黏膜IL-8含量显著低于PSE-150组和PSE-600组(P<0.05)；回肠黏膜IL-8含量与PSE添加水平呈显著线性和二次关系(P<0.05)。PSE-300组、PSE-450组和PSE-600组的回肠黏膜IL-10含量显著高于对照组(P<0.05)，回肠黏膜TNF-α含量显著低于对照组(P<0.05)，回肠黏膜IL-10和TNF-α含量与PSE添加水平呈显著线性关系(P<0.05)。PSE-450组和PSE-600组的回肠黏膜IgG含量显著高于对照组(P<0.05)，PSE-150组、PSE-300组、PSE-450组和PSE-600组的回肠黏膜IgA含量显著高于对照组(P<0.05)；回肠黏膜IgA和IgG含量与PSE添加水平呈显著线性关系(P<0.05)。

表6 饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠黏膜免疫指标的影响

3 讨 论

3.1 饲粮中添加PSE对断奶仔猪生长性能的影响

生长性能是畜牧生产中最为直观的指标。前人研究表明，用PSE饲喂雌性小鼠可以使其子代拥有较高的瘦体重指数、握力、比目鱼肌纤维数量和腓肠肌中IIb型肌纤维的比例，表明通过饲喂PSE，小鼠的后代具有更高的生长潜力[15]。许栋等[16]研究发现，饲粮中添加PS能够显著提高育肥猪的末重、平均日增重、平均日采食量，降低料重比。贾代汉等[17]研究发现，饲粮中添加PS使生长猪的平均日增重提高了12.16%，总采食量提高了3.57%，但均不显著。Cheng等[18]研究发现，饲粮中添加40、60、80、100 mg/kg的β-谷甾醇降低了肉鸡的料重比。Zhao等[10]研究发现，饲粮中添加20、40、80 mg/kg的PS可以提高整个生长期麻鸡的平均日增重，并且使其料重比呈显著线性降低。在白羽肉鸡的试验中，饲粮中添加40和80 mg/kg的PS显著提高了其平均日采食量和平均日增重[19]。本试验结果表明，饲粮中添加PSE提高了断奶仔猪的平均日采食量，这与前人的研究结果相似，但本研究中仔猪末重、平均日增重的提高程度与料重比的降低程度并不显著。前人曾经报道，PS可导致轻微腹泻[20]，影响脂质代谢产物，减少饮食造成的脂质积累[21]。在本试验中，各组之间断奶仔猪的腹泻率无显著差异，由此可推断，导致断奶仔猪平均日增重无显著差异的原因可能为PSE减少了动物体脂质的积累，并且正试期时连续降雨，气温较低，空气湿度较大，仔猪的维持需要增加。李伟等[22]研究发现，饲粮中添加40 mg/kg的PS显著降低了仔猪的平均日采食量，与本试验结果相反，原因可能为添加剂的种类、剂量、有效成分不同。

3.2 饲粮中添加PSE对断奶仔猪养分表观消化率的影响

养分表观消化率直接反映动物对养分的利用程度。有关PSE对断奶仔猪养分表观消化率的影响研究鲜有报道。程业飞等[23]研究表明，饲粮中添加30 mg/kg的PS可以显著提高育肥猪的养分表观消化率。贾代汉[24]试验发现，饲粮中添加40 mg/kg的PS能提高肉仔鸡粗脂肪、粗蛋白质、能量、干物质表观利用率。本试验中，饲粮中添加300、450、600 mg/kg的PSE显著提高了断奶仔猪粗脂肪、粗蛋白质、干物质、有机物表观消化率及表观消化能。Chen等[25]报道，PSE是一种可以改善断奶仔猪回肠绒毛高度/隐窝深度 (VH/CD)、提高回肠闭合蛋白表达水平的物质，具有增加消化吸收面积、改善肠道形态、保障肠道健康的作用。本试验中，饲粮中添加PSE能够提高肠道免疫能力，有利于构建肠道免疫屏障，提高肠道健康状态，增加肠道消化酶活性，从而提高肠道对饲料养分的消化率。

3.3 饲粮中添加PSE对断奶仔猪血清生化指标的影响

众多研究表明，PSE具有调节脂质代谢的作用，主要影响血清TC、TG、TBA、HDL-C、LDL-C等指标。高密度脂蛋白(HDL)的主要作用是将胆固醇从肝外组织转运至肝脏进行代谢，降低血清TC含量；低密度脂蛋白(LDL)的主要作用是运载胆固醇至外周组织，血清LDL-C含量与疾病发生几率呈正相关，而PS与胆固醇具有相似的化学结构，两者会在消化道内互相竞争吸收位点，因此PS可以降低肠道内吸收胆固醇的含量，并通过增加HDL-C/TG、HDL-C/LDL-C，改善血脂状态[26]。Han等[5]在敲除载脂蛋白E基因的小鼠饲粮中添加亚麻籽油与PS，显著提高了小鼠血清HDL-C含量；Bertolami等[27]研究表明，PS与依泽替米贝(一种降低血液中固醇含量的药物)类似，能提高血清HDL-C含量。本试验结果表明，饲粮中添加150、300、450 mg/kg的PSE提高了断奶仔猪血清HDL-C含量，且当饲粮中PSE添加水平为300和450 mg/kg时，一定程度上降低了断奶仔猪血清LDL-C含量，与前人研究结果相似，表明PSE能够改善断奶仔猪血脂状况。

3.4 饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠消化酶活性的影响

断奶仔猪的消化能力与其肠道消化酶活性有着密切的关系，回肠是断奶仔猪进行消化的主要场所，回肠消化酶活性直接关系到断奶仔猪对饲粮养分的利用效率。现有的研究中，有关PSE对消化酶活性的影响方面的报道较少。潘忠超等[28]报道，饲料中添加20和40 mg/kg的PS显著提高了罗氏沼虾肝脏脂肪酶活性，对肝脏蛋白酶和淀粉酶活性则没有显著影响。侯艳君等[29]研究表明，饲料中添加40 mg/kg的PS时，异育银鲫肠道内脂肪消化酶活性显著高于对照组。本试验结果表明，饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠胰蛋白酶、蔗糖酶活性无显著影响；饲粮中添加300、450和600 mg/kg的PSE能提高断奶仔猪回肠α-淀粉酶活性，其中当PSE添加水平为600 mg/kg时效果显著；饲粮中添加300、450和600 mg/kg的PSE能提高了断奶仔猪回肠脂肪酶活性，其中当PSE添加水平为450和600 mg/kg时效果显著。PSE能通过脂质代谢、转运等方式影响动物体内物质的分泌[30-31]，我们推测PSE是通过调节动物体内的脂质转运、代谢进而影响消化酶活性，具体的影响机制还需要进一步探究。

3.5 饲粮中添加PSE对断奶仔猪回肠黏膜免疫指标的影响

PS具有增强动物免疫能力的作用。Ding等[19]研究发现，饲粮中添加20和40 mg/kg的PS增加了肉鸡血清白细胞介素-1β、IFN-γ、白细胞介素-2和白细胞介素-6等抗炎因子的含量。肠道免疫指标直观地反映出肠道的健康程度。TNF-α是一种多效性促炎细胞因子，其与肿瘤坏死因子-α受体(TNFR)1和TNFR2结合后，可诱导血管舒张和白细胞黏附分子的表达，并通过水肿和白细胞迁移共同促进炎症产生[32]。IL-8通常通过结合CXC趋化因子受体(CXCR)1和CXCR2在不同的生物过程中发挥作用，CXCR1已被证明可促进癌症细胞增殖、迁移和侵袭，而肿瘤内CXCR2表达与胃癌患者的生存率相关[33]。IL-10对免疫细胞的作用包括抑制巨噬细胞和T细胞的活化以及抑制促炎细胞因子的产生[34]，IL-10还可防止B细胞凋亡，增强其增殖、分化，促进生成免疫球蛋白M(IgM)、IgG和IgA[35]。Fcγ受体(FcγRs)是一组在免疫细胞中表达的受体，在免疫中起着重要作用，IgG与FcγRs的相互作用可以诱导效应器做出相对的反应，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、抗体依赖性细胞吞噬作用、抗原呈递和细胞因子分泌作用[36]。IgG通过以上作用参与机体免疫程序。黏膜组织具有黏膜层淋巴组织，会制造出IgA以避免遭到病原的入侵[37]，黏膜表面的局部浆细胞产生二聚体IgA，在黏膜表面上皮细胞的基底外侧，二聚体IgA与聚合免疫球蛋白受体(pIgR)结合，并通过上皮转运至管腔，在进入管腔后，pIgR被切割，但一种被称为分泌成分(SC)的产物仍然与二聚体IgA保持共价连接，形成分泌型免疫球蛋白A(sIgA)[38]，sIgA与T细胞结合可使黏膜产生IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子。陈罡[39]研究发现，饲粮中添加PSE能够显著促进闭合蛋白(Occludin)的mRNA表达水平，并且PSE与丁酸甘油酯的叠加效应可以提高封闭蛋白-1(Claudin-1)的mRNA表达水平，这2种基因可以调节肠上皮稳态和上皮细胞的屏障功能。本试验研究发现，饲粮中添加300、450 mg/kg的PSE能够提高断奶仔猪回肠黏膜IL-10、IgG、IgA含量，并降低回肠黏膜TNF-α、IL-8含量，表明PSE能够有效增强断奶仔猪肠道的免疫能力，有利于构建肠道免疫屏障，维护肠道健康。

4 结 论

饲粮中添加PSE能够提高断奶仔猪的平均日采食量、养分表观消化率、回肠消化酶活性，改善断奶仔猪血脂状况，增强断奶仔猪肠道免疫能力。