温阳通脉颗粒对糖尿病模型大鼠血管内皮功能的影响*

张荔，孙付军，侯立静，盛国良，黄德红，李贵海

（1.湖北省襄阳市中医医院，湖北 襄阳 441000；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3.山东省烟台业达医院，山东 烟台 265602）

动脉粥样硬化为糖尿病常见并发症，严重威胁人类的生命健康［1］。内皮细胞障碍致使单核细胞形成泡沫细胞，同时使动脉壁纤维化，在动脉内壁上形成硬化斑块［2-4］。血浆内皮素（ET）使血管收缩，一氧化氮（NO）使血管松弛，病理状态下的ET 水平升高和NO 水平降低是内皮损伤的标志。高含量的低密度脂蛋白（LDL）和低含量的高密度脂蛋白（HDL）协同诱发动脉粥样硬化［5-6］。血管内皮生长因子（VEGF）是血管炎性反应和内皮细胞增殖的重要刺激因素，与血管内皮细胞特异性受体VEGF 受体（VEGFR）结合后能促进血管内皮细胞的增殖与分化［7］。前期体外试验已证实，温阳通脉方及其组分对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化损伤具有保护作用［8-11］。本研究将从体内试验角度探讨其作用及作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：ME204E 型电子天平、xMark 型分光光度计（梅特勒-托利多<中国>有限公司）；ReaderM 型生化仪（美国贝克曼库尔特公司）；IX73 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；A1301049 型低温高速离心机（美国Beckman公司）。

试药：羟苯磺酸钙胶囊（西安利君制药公司，批号为1205095）；温阳通脉颗粒由山东省中医药研究院生化室制备。

动物：SPF 级Wistar 大鼠120只，均为雄性，体质量200～250 g，由山东大学动物中心提供，动物合格证号为SCXK（鲁）20090001，动物许可证号为SYXK（鲁）20050052。所有大鼠均于温度为20～25 ℃、相对湿度为50%～70%、昼夜各半循环照明的环境下饲养。

1.2 方法

建模、分组与给药：120 只大鼠均适应性饲养1周，取10 只大鼠作为空白组，给予普通饲料喂养；另取110只大鼠喂养高糖高脂饲料［基础饲料66.5%（面粉20%、米粉10%、玉米20%、麸皮25%、豆粉20%、骨粉鱼粉2%），蔗糖20%，猪油10%，胆固醇2.5%，胆汁酸钠1%］1 个月，按体质量腹腔注射链尿佐菌素溶液50 mg/kg，继续给予高糖高脂饲料喂养72 h，禁食8 h后断尾，测定大鼠空腹血糖，>11.1 mol/L 即为建模成功。除空白组大鼠外，将建模成功的大鼠随机分为模型组，羟苯磺酸钙组（0.135 g/kg），温阳通脉颗粒高、中、低剂量组（5.000，2.500，1.250 g/ kg），各10 只。羟苯磺酸钙组和温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠分别灌胃相应药物，空白组和模型组大鼠均灌胃等量生理盐水，每天1次，连续30 d。

指标测定：大鼠颈外静脉采血，分离血清，测定血糖及血清ET，NO，LDL，HDL 和三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、糖化血红蛋白（HbA1C）水平。取血后处死大鼠，分离主动脉，进行免疫组化检查，观察大鼠VEGF 阳性细胞数和阳性细胞面密度，并计算阳性表达率。其中，阳性细胞面密度=阳性目标总面积/统计场总面积。免疫组化选择阳性细胞较集中的区域，采集3 个光镜视野，输入到HPIAS -1000 型高清晰度彩色病理图文分析系统内，在相同背底倍体条件下选择相应参数进行计算机完全定量分析，软件包由武汉同济医科大学千屏影像工程公司提供。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计学软件分析。计量资料以表示，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 给药前大鼠体质量和血糖比较

与空白组比较，给药前模型组大鼠体质量均显著减轻，血糖均显著升高（P<0.05）；羟苯磺酸钙组和温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠的体质量和血糖与模型组比较均无显著差异（P>0.05），提示造模成功。详见表1。

表1 给药前大鼠体质量和血糖比较（，n=10）Tab.1 Comparison of the body mass and blood glucose of rats before the administration（，n=10）

表1 给药前大鼠体质量和血糖比较（，n=10）Tab.1 Comparison of the body mass and blood glucose of rats before the administration（，n=10）

注：与空白组比较，*P <0.05。表2同。Note：Compared with those in the blank group，*P <0.05（for Tab.1-2）.

2.2 对大鼠糖代谢的影响

与空白组比较，模型组大鼠的血糖和血清HbA1C水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，羟苯磺酸钙组和温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠的血糖和血清HbA1C水平均显著降低（P<0.05）。详见表2。

2.3 对大鼠脂代谢的影响

与空白组比较，模型组大鼠的血清TG，TC，LDL 水平均显著升高，HDL 水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠的血清TG，TC，LDL 水平均显著降低，羟苯磺酸钙组和温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠的血清HDL 水平均显著升高（P<0.05）。详见表2。

2.4 对大鼠血清NO 和ET 的影响

与空白组比较，模型组大鼠的血清NO 水平显著降低，ET 水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，羟苯磺酸钙组和温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠血清NO水平均显著升高，ET水平均显著降低（P<0.05）。详见表2。

2.5 对大鼠VEGF 表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠VEGF 阳性表达率显著升高（P<0.05）；与模型组比较，羟苯磺酸钙组和温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠VEGF 阳性表达率均显著降低（P<0.05）；各组间阳性细胞面密度比较无显著差异（P>0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠观察指标比较（，n=10）Tab.2 Comparison of observation indexes of rats in each group（，n=10）

表2 各组大鼠观察指标比较（，n=10）Tab.2 Comparison of observation indexes of rats in each group（，n=10）

注：与模型组比较，△P <0.05。Note：Compared with those in the model group，△P <0.05.

3 讨论

《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》指出，中医药在糖尿病防治中有重要意义［12］。糖尿病在中医学属“消渴”范畴，以“益气、养阴、清热”为常见治则。温阳通脉颗粒由黄芪、淫羊藿、三七、黄连、红花、川芎等中药材组方，方中主要药物的有效成分黄芪甲苷、三七皂苷、淫羊藿苷对内皮细胞的氧化损伤具有保护作用［8-11］。《神农本草经疏》记载，黄芪“气旺生津止渴”，具有补气功效，其主成分能有效降低血糖［13］。《本草纲目》记载，黄连“治消渴，用酒蒸黄连”，为降糖圣药，具有清热泻火功效，黄连碱能显著下调半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达，抑制内皮细胞损伤［14-15］。川芎的主要有效成分能改善糖尿病模型大鼠的血液流变学指标［16］。黄芪注射液联合三七总皂苷可调节血栓素A2/前列腺素I2（TXA2/PGI2）和组织型纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制物-1（t -PA/ PAI -1）的平衡，而减轻血瘀证［17］。三七总皂苷和淫羊藿苷对大鼠心肌细胞的衰老具有保护作用，可能与调节SIRT3信号通路和减轻氧化应激有关［18］。三七-红花复方通过抗炎和抗凋亡发挥对心肌梗死模型大鼠的保护作用［19］。

研究表明，糖尿病血管内皮功能障碍主要由氧化应激与炎症引起，源于NO 生成和激活障碍。NO 能激活鸟苷酸环化酶，进而引起细胞内环鸟苷-3'，5-磷酸介导NO的生物作用，如控制血管张力等［20-21］。ET为一种活性多肽，具有强烈的收缩血管作用，其受体存在于冠状动脉和心肌细胞中，可导致心肌缺血，其与NO 共同调节血管张力，一旦平衡被破坏就会导致体内自由基浓度升高，引发糖尿病并发症［22-23］。VEGF 为目前已知特异性最高的促血管内皮细胞生长因子，可加速内皮细胞增殖，并激活内皮型一氧化氮合酶生成NO，加速内皮损伤［24-26］。

本研究结果显示，与模型组比较，温阳通脉颗粒高、中、低剂量组大鼠的血糖和血清HbA1C，TG，TC，LDL，ET 水平及VEGF 阳性表达率均显著降低，血清HDL 和NO 水平均显著升高（P<0.05）；各组间阳性细胞面密度比较均无显著差异（P>0.05）。表明温阳通脉颗粒能改善糖尿病模型大鼠的血脂和血糖水平，保护血管内皮功能，其作用机制可能与调节NO 和ET 的释放平衡、抑制VEGF的表达有关。