不同浓度丙泊酚抑制宫颈癌HELA细胞生长和运动能力的效果及作用机制研究Δ

李利彪，张雨莹，代志慧，杨 昊，赵海平，戴晓怡

(1.内蒙古医科大学附属医院麻醉科，呼和浩特010050； 2.内蒙古医科大学附属人民医院放疗科，呼和浩特 010050； 3.内蒙古医科大学附属医院肝胆外科，呼和浩特 010050； 4.内蒙古医科大学附属医院妇产科，呼和浩特 010050)

宫颈癌是一种特发于女性的恶性肿瘤，在所有女性恶性肿瘤中该病的发病率居第2位，近年来该病的发病率明显升高，且发病逐渐呈年轻化[1]。随着宫颈癌诊疗水平的提高，病死率有所降低，但在我国该病仍是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一[2]。宫颈癌的常用治疗手段为手术，但是复发率较高。研究结果显示，宫颈癌复发的主要因素之一为恶性肿瘤细胞转移，在手术操作中减少恶性肿瘤细胞转移对降低术后复发率也有一定优势[3-4]。有研究结果发现，Notch、转化生长因子-β(TGF-β)和Wnt等信号通路参与上皮间质转化，其中最重要的通路为Wnt信号通路[5]。该信号通路可对宫颈癌细胞的转移与侵袭进行调节。丙泊酚是临床术前使用率较高的麻醉药。临床研究结果表明，丙泊酚、吗啡等麻醉药会对恶性肿瘤的进展造成一定的影响。较多研究结果发现，丙泊酚主要通过抑制Wnt/β-catenin通路而发挥抑制肿瘤发展的作用。故本研究对不同浓度丙泊酚抑制宫颈癌HELA细胞生长和运动能力的效果以及作用机制进行了研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞：宫颈癌HELA细胞(中国科学院细胞库)。

1.1.2 实验动物：60只普通级雌性成年Wistar大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，平均饲养于12个笼子内，饲养环境条件为温度15～18 ℃，湿度35%～40%。

1.1.3 仪器：Attune CytPix成像型流式细胞仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；970CRT型荧光分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；U-CTR30-2型倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；5415R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.1.4 药品与试剂：血管内皮生长因子(VEGF，上海信乎生物科技有限公司，批号为0810H2020)；基质金属蛋白酶-9(MMP-9，深圳子科生物科技有限公司，批号为201308)；Annexin V-FITC(广州博翔生物科技有限公司，批号为69060010)；增殖细胞核抗原(PCNA，深圳子科生物科技有限公司，批号为201308)；Ki67(杭州百替生物技术有限公司，批号为A20191210)；Caspase-9和Caspase-3(北京索莱宝科技有限公司，批号为20181029和20150623)；丙泊酚乳状注射液(西安力邦制药有限公司，批准文号为国药准字H20163040)；CCK试剂盒(上海抚生实业有限公司)；DMEM高糖培养基(上海博升生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，上海烜雅生物科技有限公司)；凋亡检测试剂盒(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Binding Buffer(江苏凯基生物技术股份有限公司)；碘化丙啶[PI，范德(北京)生物科技有限责任公司]。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药：(1)取丙泊酚(质量浓度分别为0、2.5、5和10 μg/mL)对人宫颈癌HELA细胞进行处理，分为高剂量组(10 μg/mL)、中剂量组(5 μg/mL)、低剂量组(2.5 μg/mL)和空白对照组(0 μg/mL)。(2)取丙泊酚(质量浓度分别为0、10、20和50 μg/mL)对60只普通级雌性成年Wistar大鼠进行腹腔注射，并对其进行分组，即高剂量组(50 μg/mL)、中剂量组(20 μg/mL)、低剂量组(10 μg/mL)和空白对照组(0 μg/mL)。

1.2.2 细胞培养：于DMEM高糖培养基(10%FBS)内培养人宫颈癌HELA细胞，置于5%CO2、37 ℃培养箱中完成，细胞传代培养，选择对数生长期细胞进行实验。

1.2.3 模型建立：使用0.25%胰酶消化宫颈癌HELA细胞，用含体积分数为0.10%的小牛血清终止培养基消化，以1 200 r/min的转速离心处理5 min(离心半径为10 cm)，上层清液去除后悬浮沉淀、记数，最后定容。将细胞悬液(2.5×108g/L)经大鼠尾静脉注射，注射后第3日观察大鼠肿瘤生长情况。发现肿瘤后10周内每周对瘤体短径和长径以超声诊断仪测量，从3周开始，检查是否出现腋窝淋巴结转移。记录生存时间，待其自然死亡后进行解剖，取新鲜瘤体组织进行相应检测。

1.2.4 CCK8检测细胞增殖：对宫颈癌HELA细胞进行常规培养，有80%以上的细胞生长融合度后，进行胰蛋白酶消化，离心处理后进行PBS溶液洗涤，对细胞进行培养基重悬，对细胞浓度进行调整，调至为1×104个/mL。选择96孔板，将90 μL细胞悬液置入每孔，4孔为1组。将不同浓度丙泊酚(0、2.5、5和10 μg/mL)置入。将CCK8试剂(10 μL)加入各孔内，混匀并进行3 h的培养，再对吸光度(波长位置450 nm)进行检测，细胞增殖计算根据CCK试剂盒说明书进行。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡：选择恒温离心机，温度控制为4 ℃，以1 000 r/min的转速离心处理5 min(离心半径为10 cm)，将Binding Buffer重悬细胞(100 μL)加入收集细胞内，并置入PI(5 μL)和Annexin V-FITC(5 μL)，混合均匀。在室温(25 ℃)下，进行15 min避光孵育，再将Binding Buffer(400 μL)置入，开展流式细胞仪检验。

1.2.6 Transwell检测细胞运动能力：对细胞进行24 h培养，完成无FBS悬浮液的制作，在恒温(37 ℃)条件下培养1 d，之后用显微镜选择任意视野，对细胞形态进行观察，并记录细胞数量。

1.2.7 大鼠模型试验：60只大鼠完成移植瘤模型建立后腹腔注射不同浓度丙泊酚(10、20和50 μg/mL)；同时设置空白对照组，选择等量0.9%氯化钠溶液注入。1个月后对肿瘤进行称重。

1.2.8 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平：采用蛋白质印迹法，选择扫描仪对蛋白质条带进行扫描，对VEGF、MMP-9、Caspase-9、Caspase-3、PCNA和Ki67蛋白质条带灰使用Imagaquent 5.1软件进行处理分析。蛋白相对表达水平=目的蛋白条带/GAPDH灰度。

1.2.9 免疫组化观察：通过PV法染色，石蜡切片后进行脱蜡，浸泡于过氧化氢甲醇溶液(3%)内，15 min后通过4%胃蛋白消化，消化15 min后将效价1∶ 50的一抗VEGF和Ki67滴入，放入湿盒内，储存恒温冰箱12 h，以PBS(0.01 mol/L)进行清洗，之后将二抗葡聚糖-酶复合物滴入，在37 ℃条件下，孵育1 h，再进行1次PBS(0.01 mol/L)清洗，显色，再通过苏木精复染60 s，脱水、封片。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 丙泊酚高、中及低剂量组与空白对照组宫颈癌HELA细胞生长比较

(1)高剂量组、中剂量组、低剂量组与空白对照组(丙泊酚0 μg/mL)宫颈癌HELA细胞经丙泊酚处理24、48和72 h后，细胞生长能力的组间差异无统计学意义(P>0.05)；96 h后，空白对照组宫颈癌HELA细胞生长能力明显高于高剂量组、中剂量组和低剂量组，低剂量组宫颈癌HELA细胞生长能力高于中剂量组、高剂量组，中剂量组宫颈癌HELA细胞生长能力高于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。(2)高剂量组、中剂量组和低剂量组细胞的PCNA、Ki67蛋白表达水平明显低于空白对照组，中剂量组、低剂量组细胞的PCNA、Ki67蛋白表达水平高于高剂量组，低剂量组细胞的PCNA、Ki67蛋白表达水平高于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图1 四组宫颈癌HELA细胞增殖倍数比较Fig 1 Comparison of the proliferation fold among four groups of cervical cancer HELA cells

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图2 四组细胞的PCNA、Ki67蛋白表达水平比较Fig 2 Comparison of the expression levels of PCNA and Ki67 protein among four groups of cells

2.2 丙泊酚高、中及低剂量组与空白对照组宫颈癌HELA细胞凋亡比较

(1)空白对照组宫颈癌HELA细胞凋亡率低于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组宫颈癌HELA细胞凋亡率低于高剂量组、中剂量组，中剂量组宫颈癌HELA细胞凋亡率低于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。(2)空白对照组Caspase-9、Caspase-3水平高于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组Caspase-9、Caspase-3水平低于高剂量组、中剂量组，中剂量组Caspase-9、Caspase-3水平低于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图3 四组宫颈癌HELA细胞凋亡率比较Fig 3 Comparison of the apoptosis rates among four groups of cervical cancer HELA cells

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图4 四组细胞的Caspase-9、Caspase-3水平比较Fig 4 Comparison of Caspase-9 and Caspase-3 levels among four groups of cells

2.3 丙泊酚高、中及低剂量组与空白对照组宫颈癌HELA细胞运动比较

(1)空白对照组单位面积侵袭细胞数目高于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组单位面积侵袭细胞数目高于高剂量组、中剂量组，中剂量组单位面积侵袭细胞数目高于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。(2)空白对照组细胞的VEGF、MMP-9蛋白表达水平高于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组细胞的VEGF、MMP-9蛋白表达水平高于高剂量组、中剂量组，中剂量组细胞的VEGF、MMP-9蛋白表达水平高于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6。

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图5 四组单位面积侵袭细胞数目比较Fig 5 Comparison of the number of invasive cells per unit area among four groups

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图6 四组细胞的VEGF、MMP-9蛋白表达水平比较Fig 6 Comparison of the expression levels of VEGF and MMP-9 protein among four groups of cells

2.4 丙泊酚高、中及低剂量组与空白对照组宫颈癌HELA细胞Wnt1/β-catenin通路比较

空白对照组细胞的Wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表达水平高于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组细胞的Wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表达水平高于高剂量组、中剂量组，中剂量组细胞的Wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表达水平高于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图7。

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图7 四组宫颈癌HELA细胞 Wnt1/β-catenin通路蛋白表达比较Fig 7 Comparison of expressions of Wnt1/β-catenin pathway protein among four groups of cervical cancer HELA cells

2.5 丙泊酚高、中及低剂量组与空白对照组大鼠体内肿瘤情况比较

(1)空白对照组大鼠肿瘤重量高于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组大鼠肿瘤重量高于高剂量组、中剂量组，中剂量组大鼠肿瘤重量高于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图8。(2)免疫组化染色显示，空白对照组的VEGF和Ki67为淡黄色，代表阳性；丙泊酚处理染色显示，VEGF和Ki67为蓝色，丙泊酚浓度越低，其显色越轻，见图9。(3)空白对照组大鼠VEGF、Ki67阳性细胞数目百分比高于高剂量组、中剂量组及低剂量组，低剂量组大鼠VEGF、Ki67阳性细胞数目百分比高于高剂量组、中剂量组，中剂量组大鼠VEGF、Ki67阳性细胞数目百分比高于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图10。

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图8 四组大鼠肿瘤重量比较Fig 8 Comparison of the tumor weights of rats among four groups of rats

图9 四组大鼠肿瘤免疫组化染色情况比较Fig 9 Comparison of tumor immunohistochemical staining among four groups rats

与空白对照组相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05图10 四组大鼠VEGF、Ki67阳性细胞数目百分比比较Fig 10 Comparison of the percentage of VEGF and Ki67 positive cells among four groups of rats

3 讨论

细胞增殖分化中，PCNA起着重要作用，细胞分裂增殖速度随着其指数升高而加快，当其持续升高，会更改细胞结构机能和形态，进而提升细胞增殖能力[6]。Ki67是一种细胞核内蛋白抗原，与细胞分裂增殖密切相关，当Ki67表达水平升高，细胞增殖能力也会随之升高[7-8]。有研究结果显示，细胞增殖与Ki67表达水平具有相关性，Ki67可用于细胞周期的调节[9]。本研究结果发现，丙泊酚处理宫颈癌HELA细胞后，其PCNA和Ki67蛋白表达明显降低，丙泊酚浓度越高则降低越明显。由此可见，丙泊酚可有效抑制、降低PCNA和Ki67蛋白表达水平，减弱宫颈癌HELA细胞的增殖能力。

细胞凋亡的重点是Caspase，该家族的凋亡因子包含Caspase-9和Caspase-3。有研究结果发现，凋亡启动因子之一为Caspase-9，Caspase-3主要执行凋亡[10-11]。Caspase-3可经Caspase-9裂解形成，Caspase底物经剪切可产生级联反应，最后引起移植瘤死亡，以发挥肿瘤细胞凋亡控制作用[12]。本研究结果显示，丙泊酚处理宫颈癌HELA细胞后，其Caspase-9和Caspase-3水平提高，可见丙泊酚能够抑制恶性肿瘤细胞的生长和增殖，最终引起细胞凋亡；此外，丙泊酚浓度越高，Caspase-9和Caspase-3水平越高，说明丙泊酚能够影响宫颈癌HELA细胞增殖，促进其凋亡。

MMP是蛋白水解酶之一，具有降解细胞外基质作用，与恶性肿瘤细胞的血管生成、运动、迁移和浸润具有相关性[13]。有研究结果提示，恶性肿瘤细胞转移和侵袭的前提是将细胞外基质(ECM)降解，并将其基底膜破坏。ECM降解最主要的蛋白酶类为MMP-9。激活MMP会产生MMP-9，对肿瘤表面进行降解和破坏，导致肿瘤细胞侵袭周边组织，引起肿瘤细胞转移与侵袭[14-15]。本研究结果显示，丙泊酚处理宫颈癌HELA细胞后，其MMP-9表达水平明显降低，表明丙泊酚能够对肿瘤的迁移与侵袭起到一定的抑制作用。

研究结果显示，Wnt/β-catenin信号通路被激活与细胞生长、分化相关，而抑制肿瘤细胞增殖可通过抑制Wnt1信号通路实现，同时还可以诱导肿瘤细胞凋亡[16-17]。研究结果发现，宫颈癌细胞中的β-catenin和Wnt1表达水平明显区别于健康正常宫颈细胞，其水平明显更高，且随着疾病的进展而升高[18-20]。本研究结果显示，宫颈癌HELA细胞经丙泊酚处理后，β-catenin、Wnt1以及c-Myc水平降低，说明丙泊酚能够对Wnt/β-catenin信号通路进行抑制，丙泊酚浓度升高，该信号通路有关蛋白表达水平降低。

综上所述，丙泊酚能够抑制宫颈癌HELA细胞的生长和运动能力，浓度越高则抑制能力越强。该作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路有关蛋白表达、抑制细胞迁移和侵袭有关蛋白以及促进凋亡因子Caspase-9、Caspase-3表达有关。