黄芩苷联合京尼平苷治疗结直肠癌关键靶点BOP1的分子对接机制研究Δ

张天泽，陈 静，张 伟，赵 彧，孙付军，郭红梅，邵 露，张乐林，林慧彬，李克明#

(1.北京中医药大学中医学院，北京 100029； 2.青岛市中医医院(青岛市海慈医院)药剂科，山东 青岛 266033； 3.青岛市中医医院(青岛市海慈医院)肛肠科，山东 青岛 266033； 4.山东省中医药研究院中药药理研究所，济南 250014； 5.山东省中医药研究院中药炮制研究所，济南 250014； 6.山东省中医药研究院中药资源研究所，济南 250014)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是人类消化道中常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球恶性肿瘤中居第2位[1]。在我国，每年新增CRC患者数为37.6万例，死亡19.1万例，且呈逐年升高趋势。多数患者在确诊时已经为晚期患者，5年存活率仅为13.1%，转移是晚期CRC患者常见的死亡原因之一。多项研究结果表明，增殖阻断1蛋白(BOP1)调节多种类型肿瘤的发生、上皮间质转化、迁移、转移和耐药性[2-3]。课题组前期研究发现，BOP1可通过调节c-Jun 氨基端蛋白激酶(JNK)通路促进CRC细胞迁移和侵袭，而敲低后可抑制JNK信号通路介导的迁移和侵袭过程[4]。因此，BOP1是CRC细胞侵袭和迁移的重要调节因子，研究控制肿瘤细胞转移的新分子可能为CRC的治疗提供有效的方法。CRC的发生发展由多个阶段组成，西药长期治疗容易产生多药耐药性，化疗手段会极大程度地影响患者自身免疫系统，而使用中药天然药物辅助治疗不良反应少，可在一定程度上逆转肿瘤多药耐药[5]。黄连解毒汤为中医名方，源自《外台秘要》引崔氏方，在临床被用于泻火解毒；现代研究结果发现，黄连解毒汤中黄芩苷、京尼平苷为其干预与逆转肿瘤多药耐药的有效成分。研究结果显示，黄芩苷和京尼平苷组合是黄连解毒汤抗肿瘤及逆转肿瘤多药耐药的主要物质基础，且黄芩苷10 μg/mL、京尼平苷20 μg/mL对肿瘤细胞增殖的抑制作用明显[6-8]。本研究通过分子对接技术，探究黄芩苷联合京尼平苷对CRC关键靶点BOP1的抑制作用，为黄芩苷联合京尼平苷的进一步开发与应用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 供受体的获取及分子模拟过程

AlphaFold数据库(https://alphafold.ebi.ac.uk/)使用机器学习方法将来自蛋白质数据库的现有蛋白质结构知识和序列比对以及物理和几何约束的信息汇总在一起，以提供蛋白质结构的预测原子模型[9-10]。其人源BOP1蛋白(UniProt ID：Q14137)原始序列文件经Maestro 11.9软件处理还原为3D模型，通过“Protein Preparation Wizard”套件自动分配键序、添加氢、与金属形成零级键、将硒代甲硫氨酸转化为甲硫氨酸、添加缺失的侧链、创建可能的二硫键、删除与配位点距离超过50 nm的杂基团，并在pH为7.0时产生杂质子化状态，最后使用OPLS3e力场进行限制最小化，直到重原子的均方根误差(RMSD)收敛达到3 nm。

配体小分子黄芩苷和京尼平苷分别以“baicalin”和“geniposide”在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索，以获取其“*.sdf”结构文件。并导入Maestro 11.9软件中，使用“LigPrep”套件，添加金属结合态，并产生互变异构体；保留了特定的手性，每个结构最多产生4个立体异构体。生成在pH为5.0～9.0下的最低能量分子状态。

1.2 活性位点模拟及对接

通过SiteMap算法在域-域界面识别表观遗传蛋白的小分子结合位点，将活性部位等效为白色格点，并确定排序靠前的潜在受体结合位点作为该蛋白的最终活性位点[11]。通过“Receptor Grid Generation”套件确定对接盒子区域大小以及中心位置，以供配体小分子对接。

1.3 结合模式分析

蛋白质-配体相互作用谱分析(protein-ligand interaction profiler，PLIP)是由德国德累斯顿工业大学开发的一款基于Python 3的开源工具(https://github.com/pharmai/plip)，可用于识别蛋白质受体与其配体之间的非共价相互作用[12]。将“配体-受体”对接态分子导入PLIP平台，通过结构准备、功能表征和基于规则的匹配的相互作用过滤将结构氢化，并提取配体与其结合位点输出特征数据，最后进行相互作用检测和可视化。

2 结果

2.1 蛋白3D模型还原与检验

下载BOP1原始序列，整理为“MAGSAGAGATAAPSVAPG LAASGPGLGPGPGPGPPLLCTSPLSHSTGSASGVSASGGSVPSGL GASGSASSGAAAGGAGGGGAGALAAGGHSGILLTTGGGVGAST PCPATGMASAAIGAGTAGASSAGGAIAATVGAVPLGTTAAPPH VGTALAGAAITLPLATAAGLAGPLALMAAPATTATVGAPMTGA ALALTAGGVALVAALGSGGPGAVGPAPTGPAVAPPSGAVMIHP VTAAPAALASPIPSLVGLGLVSAMVHAILMGTIGPAAPAAPTPSP TALTAGGAPAAVLGAHLMHVPAPLLALPGHAGSTAPPPGTLLS GGGALATGGGGPGGALLSPLPALPPSLAAVPATGAPIGGAPGA CLALTLCPAGALMAVAVAPGALIPLLPAPAALGPPPTCGALVT AGHSALVACLSVSPGGGTLVSGSAAGSLALTGVATAACVATVP VGGVVLSVATAPSPAVCLVAAAVGASVLLLAPALGAALVAGST AGLLSAPVPPGGPPLGPAATLGASGGGAGVGLALAICHGLPVT GVTTHGAGATLAVVLATGGHTGVLIHGLSAAASGSPPAASHGG VGAVAPHPAAPPLLVASGASVALTHLLAGGLTLLLMPACLTVSS LAVHPAGAAVICGSTASLLVTPALALSTLPTAMLAHHLLALAAV APHPATPLPASGSAAGSVIVCHGMVTAALLGAPLLVPVLVLLG HVLTAALGVLAVIPHPTGPTVPSSGAAGTVALPT”，导入Maestro 11.9软件进行处理，结构还原后的预测对齐误差见图1。图1表示，当预测结构和真实结构在残基y上对齐时，位置(x，y)处的颜色表示AlphaFold 在残基x处的预期位置误差。依据软件算法对还原的结构打分，产生每个残基的置信度分数(pLDDT)并分为4级：非常高(pLDDT≥90)，确信(pLDDT为70～<90)，低(pLDDT为50～<70)，非常低(pLDDT<50。处理后的BOP1大部分残基pLDDT均>90，代表模型置信程度非常高，可以用于对接研究，处理后的条带模型和表面模型结构见图2。

图1 构建蛋白预测对齐误差Fig 1 Constructed protein prediction alignment error

图2 还原BOP1蛋白的条带模型和表面模型示意图Fig 2 Schematic diagram of the band model and surface model of the reduced BOP1 protein

2.2 高精对接盒子设置

使用SiteMap算法检查涉及识别和修改蛋白标记的多个域的结构，确定了域-域接口处的5处潜在结合位点，并按置信度命名为site1—site5。选用site1处位点计算生成对接盒子，进行下一步的对接，见图3。

图3 计算site1结合位点域与对接盒子示意图Fig 3 Schematic diagram of calculating site1 binding site domain and docking box

2.3 对接结果及结合模式

通过Glide算法计算黄芩苷与BOP1靶点对接结合分数为-6.401，京尼平苷与BOP1靶点对接结合分数为-6.241。通过PLIP分析，黄芩苷与BOP1生成了10个氢键相互作用、1个疏水作用和1个盐桥(见表1)，其3D结合模式图见图4(A)，对接细节见图4(B)；京尼平苷与BOP1生成了6个氢键相互作用(见表2)，其3D结合模式图见图4(C)，对接细节见图4(D)。

表1 黄芩苷与BOP1对接的相互作用力Tab 1 Interaction force between baicalin and BOP1 docking

A.黄芩苷与BOP1的3D结合模式图；B.黄芩苷与BOP1的对接细节图；C.京尼平苷与BOP1的3D结合模式图；D.京尼平苷与BOP1的对接细节图A.3D binding pattern of baicalin and BOP1；B.details of the docking of baicalin and BOP1；C.3D binding pattern of geniposide and BOP1；D.details of the docking of geniposide and BOP1图4 黄芩苷和京尼平苷与BOP1的分子对接模式图Fig 4 Molecular docking pattern of baicalin and geniposide with BOP1

表2 京尼平苷与BOP1对接的相互作用力Tab 2 Interaction force between geniposide and BOP1 docking

3 讨论

CRC为常见的消化道恶性肿瘤，据统计，其在世界范围内的患病率为5%，我国的CRC患者数在全球CRC患者中占比高达31%，且<50岁人群的CRC发病率以每年2%的速度增长，肝转移和肺转移是致死的重要原因[13-15]。前期课题组的实验研究结果表明，黄连解毒汤的抗肿瘤作用与其含有的黄芩苷、京尼平苷有关[7-8]。因此，对黄芩苷联合京尼平苷的抗CRC作用机制进行分析，对于降低患者风险、抑制肿瘤扩散有着重要意义。BOP1为WD40蛋白家族的成员，具有4个WD重复基序，包括732个氨基酸，在真核生物中高度保守，已被确定为60S核糖体生物发生和核糖体RNA加工的重要调节因子[16]。据报道，BOP1是在几种恶性肿瘤中表达紊乱，并参与促进肿瘤的发生和发展[17-18]。课题组前期研究结果表明，BOP1通过JNK通路促进人CRC细胞迁移和侵袭，因此，BOP1可以用作各种肿瘤的有前途的分子预后生物标志物，在各种恶性肿瘤中的表达将导致不同的临床结果[4]。经检索发现，BOP1暂无已发表的可用的3D结构，因此，本研究基于人源BOP1蛋白(UniProt ID：Q14137)的原始序列文件建模其蛋白结构用于对接，经检验构建的模型置信程度非常高，可以用于后续的精细对接研究。

本研究基于分子对接技术，探索黄芩苷联合京尼平苷的抗CRC作用靶点BOP1的调节作用。在Glide对接算法中，受体-配体亲和力越强，构象越稳定，其靶点对接结合分数的绝对值越大；绝对值>4.25代表有结合活性，>5.0代表有较强的结合活性[19-20]。从结果来看，黄芩苷、京尼平苷与BOP1靶点对接结合分数分别为-6.401、-6.241，均具有较好的结合活性，在一定程度上说明了二者能够通过结合BOP1，从而实现一定的生理功能。

SiteMap是一种新技术，用于识别潜在的结合位点并预测其在先导发现应用中的成药性，以及在先导优化应用中表征结合位点和批判性评估预期配体[21]。在大规模验证测试中，SiteMap的结果中有>98%的部分来自与配体紧密结合的位点，还可以准确地区分结合配体的位点和不结合的位点。本研究使用SiteMap分析计算了BOP1的5个可能活性位点，其中site1的置信度最高，因此，选用site1处位点作为BOP1的活性位点与配体对接。

随着蛋白质结构数据的增长，配体与其目标分子之间的分子相互作用的分析变得越来越重要，并对药物发现产生重大影响。PLIP可提供高质量图像、PyMOL会话文件(*.pse)来生成自定义图像和可解析的结果文件，促进了后续数据处理的效率。在动力学方面，黄芩苷和京尼平苷均能完美对接到BOP1的计算活性位点site1处，且能通过生成大量氢键稳固对接关系。氢键是有机体内最常见的一种作用力，在生物结构、功能和构象动力学中起着不可或缺的作用，是地球上生命进化的基础。有研究结果表明，亲水或带电蛋白质表面存在水分子时，氢键断裂的自由能高达1.67 kJ/mol。因此，笔者认为黄芩苷、京尼平苷与BOP1对接主要依靠生成的氢键相互作用。

综上所述，有了丰富的对接数据，可以深入了解黄芩苷、京尼平苷如何与靶标BOP1相互作用。这些相互作用模式的详细表征对于了解药物分子识别、蛋白质功能或开发和优化先导化合物至关重要，因此被广泛应用于对接后处理、抑制剂设计以及药物定位等[22-23]。基于此，本研究探索了黄芩苷联合京尼平苷通过影响BOP1治疗CRC的可能，对临床用药有一定的参考意义。计算机理论研究结果并不能完全还原真实情况，因此，课题组会进一步采用实验验证该结果。