江淮部分地区麦田日本看麦娘对精噁唑禾草灵的抗性及其交互抗性

许锦程，毕亚玲，李君君，戴魏真，许孟桃，谷承文

(1.安徽科技学院资源与环境学院，安徽凤阳 233100；2.安徽科技学院农学院，安徽凤阳 233100)

随着除草剂使用面积的大幅度增加，杂草抗性问题已成为其高效应用的阻碍。化学除草剂长期施用导致抗性杂草的数量快速上升[1]。截至目前，共有263种杂草(双子叶植物152种，单子叶植物111种)对除草剂产生不同程度抗药性[2]。精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)属于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(acetyl-coA carboxylase,ACCase)，在我国用药历史较长，因其活性高、防效好等优点被广泛应用于防治日本看麦娘(Alopecurusjaponicus)[3-5]。其主要通过抑制丙二酰辅酶和ADP的形成从而发挥作用，使植物无法正常合成所需的脂肪酸，导致日本看麦娘死亡[6]。但郭 峰[7]于2011年报道，采自河南、江苏、山东等地的日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵已产生不同程度的抗药性，抗性指数高达35.64；毕亚玲等[3]在2015年报道，采自安徽省定远县的日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的抗性指数达33.82。抗性日本看麦娘等禾本科杂草的大面积发生，现已成为威胁小麦高产、稳产的重要阻碍。

目前，关于杂草抗性的研究主要集中在靶标抗性(TSR)和非靶标抗性(NTSR)两方面。徐洪乐[8]在2015年证实，基因表达量差异是导致日本看麦娘产生靶标抗性的原因之一；赵 宁[9]在2019年发现，乙酰乳酸合成酶基因1 781位突变是导致日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗性的重要原因。非靶标抗性主要包括屏蔽、隔离、代谢三种作用方式，其中除草剂的代谢作用较广泛，所涉及的代谢酶类主要为谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)和细胞色素P450氧化酶等，其能够在机体受到有毒物质威胁时，将有毒物质代谢掉，保护细胞免受伤害，在许多生物体内担任解毒系统角色[10]；因其能够参与调节杂草内部的解毒代谢活性，所以其代谢能力增强目前被认为是高等植物对除草剂产生非靶标抗性的主要原因[11]。

江淮地区是我国重要的小麦产区之一，日本看麦娘等禾本科杂草在小麦田的发生较为严重[12]。而目前关于杂草抗性的研究多集中在靶标抗性和抗性检测方面[13-17]。基于此，本试验采集江淮部分地区日本看麦娘种群，测定其对精噁唑禾草灵的抗性水平及部分种群的ACCase基因，将GSTs酶抑制剂灭草环、三聚氯氰、NBD-Cl和P450s酶抑制剂PBO、马拉硫磷与精噁唑禾草灵联合作用，以探寻日本看麦娘可能存在的靶标抗性机制和GSTs、P450s代谢酶抑制剂对精噁唑禾草灵的作用；并测定抗精噁唑禾草灵种群对8种不同类型除草剂的抗性，为该麦区科学防除抗性日本看麦娘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试种群

供试日本看麦娘种群种子于2019-2020年采自江淮部分地区麦田，以未施用除草剂的非耕地田块种子为对照，具体种群信息如表 1，种子晾晒风干后置于0～5 ℃冷藏库中保存待用。

表1 不同日本看麦娘种群信息

1.1.2 供试药剂

除草剂：69 g·L-1精噁唑禾草灵水乳剂(fenoxaprop-P-ethyl)，拜耳作物科学(中国)有限公司；108 g·L-1高效氟吡甲禾灵乳油(haloxyfop-R-methyl)，山东汤普乐作物科学有限公司；15%炔草酯可湿性粉剂(clodinafop-propargyl)，浙江天丰生物科学有限责任公司；5%唑啉草酯乳油(pinoxaden)，瑞士先正达作物保护有限公司；12.5%烯禾啶乳油(sethoxydim)，中农立华(天津)农用化学品有限公司；30 g·L-1甲基二磺隆油悬浮剂(mesosulfuron-methyl)，拜耳作物科学(中国)有限公司；7.5%啶磺草胺水分散粒剂(pyroxsulam)，科迪华农业科技有限责任公司；70%氟唑磺隆水分散粒剂(flucarbazone-sodium)，浙江天一生物科技有限公司；50%异丙隆可湿性粉剂(isoproturon)，江苏快达农化股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 日本看麦娘培养

选择饱满度相同的日本看麦娘种子，用75%酒精对种子进行消毒3～5 min，再用蒸馏水清洗种子三次；置于已灭菌的培养皿中，于GXZ型光照智能培养箱培养(光/暗): 12 h/12 h; 温度：24 ℃/20 ℃)；待种子催芽露白(3 d)之后，均匀播入含有营养混合土(砂土∶基质=1∶1，总养分含量63%)的直径为12 cm塑料盆中，每盆15颗，覆土0.5 cm以盖住种子，吸透水后置于温室内(光/暗): 16 h/8 h; 温度：25 ℃; 相对湿度60%～75%)培养。定期观察日本看麦娘的生长情况，当日本看麦娘长至一叶一心期，剔除过大和过小幼苗，定苗至每盆10株。

1.2.2 不同日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的抗性水平测定

采用整株水平生物测定法，参照《农药室内生物测定试验准则》NY/T 1155.4-2006进行[18]。根据预试验设计剂量，麦田种群剂量为0、15.0、45.0、135.0、405.0和1 215.0 g(a.i.)·hm-2，对照种群剂量为0、1.7、5.0、15.0、45.0和135.0 g(a.i.)·hm-2。不同种群共设6个处理，每处理3次重复。药剂的配制使用母液稀释梯度法，用0.1%的吐温-80水溶液稀释定容配制成母液，以0.1%吐温-80水溶液(不含药剂)做空白对照[19]。待日本看麦娘长至3叶1心，使用HCL-2000行走式喷雾塔对日本看麦娘精准喷雾，喷液压力40 psi，扇形喷头，喷液量450 L·hm-2，喷液面距离日本看麦娘顶端叶片50 cm[20]。施药后置于日光温室内继续培养，温、湿度管理同上。药后21 d剪取日本看麦娘地上部分，称量鲜重，计算鲜重抑制率(对照地上部分鲜重-各处理地上部分鲜重)/对照地上部分鲜重×100%)；以试验剂量对数值(x)与鲜重抑制率几率值(y)拟合毒力回归方程(y=a+bx)，计算GR50值及95%置信限；计算抗性指数(resistance index,RI抗性种群GR50/敏感种群GR50)。杂草抗性分级标准如下，中抗性：RI≤10.00；高抗RI>10.00[2]。

1.2.3 不同抗性日本看麦娘种群ACCase基因差异检测

从各地区中各选取一个高抗、中抗种群和敏感种群进行测定。日本看麦娘培养至3叶1心时，剪取植株幼嫩叶片组织，置于-80 ℃超低温冰箱中保存。DNA的提取采用CTAB法[21]。使用已报道的ACCase基因序列(JQ068820.1)设计引物[22]，扩增引物为FP : 5′-TTTCCCAGCGGCAGACAGAT-3′，RP : 5′-TCCCTGGAGT- CTTGCTTTCA- 3′，琼脂糖凝胶电泳后，将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对测序结果进行分析。扩增的区域包含已证实的ACCase CT区域发生突变的7个位点[3]。

1.2.4 GSTs、P450s酶抑制剂对精噁唑禾草灵的效应测定

供试种群同1.2.3，待日本看麦娘长至3叶1心，分别喷施灭草环150 g(a.i.)·hm-2、三聚氯氰180 g(a.i.)·hm-2、NBD-Cl 270 g(a.i.)·hm-2、PBO 4 200 g(a.i.)·hm-2、马拉硫磷 1 000 g(a.i.)·hm-2，待叶片上雾滴晾干(约 1 h)，喷施不同剂量精噁唑禾草灵，喷施剂量同 1.2.2，以单独施用精噁唑禾草灵对照，不同处理三次重复。药后28 d计算施用酶抑制剂后的GR50和各参数，按下式计算增效倍数。

增效倍数(SR)=单剂的GR50/(酶抑制剂+单剂)的GR50

1.2.5 抗精噁唑禾草灵种群对其他除草剂的抗性测定

为明确抗性种群对不同类型除草剂的抗性，选取8种小麦田除草剂进行试验，方法同1.2.2，试验剂量见表2。

表2 供试除草剂及测定剂量

1.3 数据分析

使用DPS 7.05对数据进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 日本看麦娘对精噁唑禾草灵的抗性分析

由表3可见，供试日本看麦娘各种群均对精噁唑禾草灵产生了不同程度的抗性。对照AH-7对精噁唑禾草灵较敏感，GR50值为25.21 g(a.i.)·hm-2。安徽省供试种群AH-40、AH-42、AH-43、AH-44均达到高抗水平，抗性指数分别为18.54、14.90、14.68、 14.12，占种群总数的40%；其中，采自安徽省淮南市凤台县夏集镇的种群AH-40的GR50值最高，为467.28 g(a.i.)·hm-2，是其大田推荐剂量62.1 g(a.i.)·hm-2的7.5倍。江苏省供试日本看麦娘种群仅有JS-19达到高抗水平，占供试种群总数的10%，其他均为中抗，但其GR50仍高于该药剂的推荐剂量。供试日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的抗性为：AH-40>AH-42>AH-43>AH-44>JS-19>JS-21>JS-20>JS-18>AH-41(表3)。

表3 日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的抗性水平

2.2 抗性日本看麦娘ACCase基因分析

对日本看麦娘敏感种群AH-7、抗性种群AH-40、AH-41、JS-19、JS-20进行ACCase基因扩增序列(JQ068820. 1)同源性均达95.8%以上，确定扩增序列为日本看麦娘ACCase基因序列。将测序结果与日本看麦娘(A.japonicus)的ACCase基因序列进行比对，供试种群在可引起靶标抗性的位点处均未发现突变。

2.3 GSTs、P450s代谢酶抑制剂对精噁唑禾草灵的效应

如表4所示，喷施GSTs酶抑制剂后，敏感种群AH-7对精噁唑禾草灵的敏感性略有增加；抗性种群AH-40、JS-19 对精噁唑禾草灵的GR50值均下降，其中，NBD-Cl能显著降低抗性种群AH-40对精噁唑禾草灵的抗性，增效倍数达2.45；而抗性种群AH-41、JS-20对精噁唑禾草灵的GR50并未有下降的趋势，表明GSTs酶抑制剂未对其产生增效作用。由表5可知，施用2种P450s酶抑制剂后，AH-40种群对精噁唑禾草灵的GR50有所下降，增效倍数为1.64～2.03，表明P450s酶抑制剂对该种群具有增效作用；而AH-41、JS-19、JS-20在施用P450s酶抑制剂后，并未产生增效作用。结果显示，施用代谢酶抑制灭草环、三聚氯氰、NBD-Cl、PBO、马拉硫磷后，抗性种群AH-40对精噁唑禾草灵的GR50均有所下降；施用灭草环、三聚氯氰、NBD-Cl后，抗性种群JS-19对精噁唑禾草灵的GR50有所下降。供试酶抑制剂对其他抗性种群未产生明显增效作用。

表4 添加GSTs酶抑制剂后对日本看麦娘各种群的剂量反应曲线参数比较

表5 添加P450s酶抑制剂后对日本看麦娘各种群的剂量反应曲线参数比较

2.4 抗精噁唑禾草灵种群对其他除草剂的抗性

由表6可知，抗性种群AH-40对炔草酯、甲基二磺隆表现为高抗，抗性指数为14.67、19.91，对其他供试药剂均表现为中抗，对唑啉草酯、啶磺草胺、异丙隆敏感，抗性指数在0.59～2.09之间。AH-41对高效氟吡甲禾灵、炔草酯、甲基二磺隆表现高抗，抗性指数分别为 16.40、18.93、28.84，而对其余药剂中抗。JS-19对高效氟吡甲禾灵、炔草酯、甲基二磺隆高抗，抗性指数分别为 50.32、19.37、 28.42，对唑啉草酯、啶磺草胺、异丙隆敏感。JS-20对炔草酯、烯禾啶、甲基二磺隆表现为高抗，而对啶磺草胺、异丙隆较为敏感。综上所述，4个抗性种群均对炔草酯、AH-41和JS-19对高效氟吡甲禾灵、JS-20对烯禾定均有高水平抗性，其他抗性种群对各药剂的抗性水平均在中等抗性水平范畴。此外，4个供试抗性种群均对甲基二磺隆高抗，但均对唑啉草酯、啶磺草胺、氟唑磺隆、异丙隆较为敏感，可作为江淮地区防除抗性日本看麦娘的替代药剂。

表6 抗性种群对8种除草剂的抗性

3 讨 论

日本看麦娘是江淮地区冬小麦田的恶性杂草之一，黄红娟等[23]、高兴祥等[24]通过调查长江中下游与黄淮海地区小麦田杂草群落发现，日本看麦娘在优势度比较中均排在前列，严重影响着该地区小麦的高质量生产。本研究通过测定采自江淮地区的日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的抗性水平发现，供试种群均对精噁唑禾草灵产生了不同程度的抗性，产生高水平抗性的种群数量占种群总数的50%，抗性指数最高达18.54，这与赵 宁等[9]的研究结果略有不同，可能与采集地点有关系。造成日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗药性的原因与当地经济发展水平、用药习惯、单一药剂的使用年限和耕作制度等因素均有关系。

相较于靶标抗性，杂草非靶标抗性的不确定因素较多，而代谢抗性能力增强目前被认为是植物由体内的P450s、GSTs等酶协同作用，将除草剂代谢为低毒物质等引起的。葛鲁安等[25]研究证明，杂草的代谢能力与P450s、GSTs酶活性有关，使其产生非靶标抗性。本研究结果表明，供试种群AH-40、JS-19在施用GSTs酶抑制剂后，对精噁唑禾草灵的GR50均有很大程度下降，表明GSTs酶抑制剂对该种群具有增效作用；施用P450s酶抑制剂后，AH-40种群对精噁唑禾草灵的的GR50有所下降，增效倍数为1.64～2.03倍。

综合试验结果，表明酶抑制剂对精噁唑禾草灵有增效作用，但精噁唑禾草灵在日本看麦娘体内的具体增效机制还需进一步研究。

杂草体内物质代谢是十分复杂的过程，需要多种酶和器官同时参与，导致其对除草剂产生不同程度的抗性[26]。徐洪乐等[8]研究发现，抗精噁唑禾草灵的日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵、炔草酯等药剂均已产生抗性；而相关试验研究表明，日本看麦娘易对作用机制相同的除草剂产生抗性，产生原因与化学结构简单及对不良环境的适应等因素有关[7,27]。本研究通过测定抗性日本看麦娘的抗性发现，4个抗性种群均对炔草酯和甲基二磺隆、AH-41和JS-19对高效氟吡甲禾灵、JS-20对烯禾啶产生了高水平抗性，但对唑啉草酯、啶磺草胺、氟唑磺隆和异丙隆较为敏感，其可作为江淮地区防除抗性日本看麦娘的替代药剂。