微流控芯片及其在肿瘤研究中的应用进展

赵淼，包永睿，2，3，王帅，2，3，李天娇，2，3，孟宪生，2，3*（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600）

微流控芯片（microfluidic chip）是以分析化学为基础，微机械和纳米技术为依托，并随着生物化学与生物医学工程发展而兴起的一门交叉学科[1]。相较于传统实验室操作，微流控技术具有微型化、样品消耗少、分析速度快、易于集成等优点[2]，其设计原则为将流体在微观领域的物理和化学特性发挥最大化，实现流体与微小物体的操控，从而完成分析测试过程。微流控技术通过与生物技术和电子设备相结合，可以在芯片中构建一种与体内环境相似的微环境，并能对芯片中的实验实现全程监测和实时控制。目前微流控技术广泛应用于细胞培养、高通量药物筛选、生物化学分析检测以及临床诊治[3-4]等领域。

1 微流控芯片技术研究

微流控芯片又称芯片实验室（lab on a chip），是一种可在微米尺度下精确操控流体的新技术，具有微型化和高通量的特点，并兼具可单元组合和功能集成的优势[5-7]。其最基本的结构特征是微米级的微通道系统，因此需要相配的制作材料、加工工艺以及结构单元。

1.1 微流控芯片的制作材料

在微流控芯片制作过程中，首先要考虑芯片材料的选取。芯片材料选择上的主要考量因素为材料的气密性、导电性、散热性、透光性、溶剂耐受性、化学和生物相容性等。常用于制作微流控芯片的材料有单晶硅、玻璃和有机聚合物，如聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（polycarbonate，PC）以及水凝胶等，不同材料制备微流控芯片的优缺点见表1。早期的微流控芯片由玻璃和硅制作而成，优点在于高温下的化学稳定性、高强度和导热特性，可以在表面加工实现精确的纳米级图案结构[8-9]。例如硅材料广泛应用于三维培养结构中的微反应器和细胞培养腔室；玻璃的机械强度较高，是制作PCR 芯片的主要材料。硅弹性体PDMS 因成本低廉、制作快捷、设备门槛低，目前已成为制作微流控芯片的首选材料[10]，且其气体透过性良好，有利于细胞培养中的气体交换[11]，疏水表面也更容易被细胞黏附[12]，因此多用于细胞培养、药物筛选及制作生化分析器件[13]。热塑性材料因具有良好惰性、溶剂耐受性且加工成本低等特点，在商业化产品中被大量使用，常见的热塑性材料有PMMA、PC、聚苯乙烯、聚氯乙烯及全氟代聚合物。PMMA 具有良好的热加工、光学性能和生物兼容性，在细胞培养等生命科学领域具有广泛应用[14-15]。水凝胶材料包括人工合成高分子聚合物[如聚丙烯酰胺（PAAM）、聚乙二醇（PEG）等]以及天然水凝胶（琼脂糖凝胶、海藻酸钠凝胶、明胶等），因其具有高通透性、高含水量的特性，常用于在体外模拟体内的血管结构[16]以及构建细胞共培养微环境等。

表1 微流控芯片制作材料的优缺点Tab 1 Advantages and disadvantages of microfluidic chip materials

1.2 微流控芯片的制作方法

微流控芯片上微通道的加工有多种方法，玻璃类芯片多采用光刻法和蚀刻法，高分子聚合物芯片所采用的制作技术包括热压法、模塑法、注塑法、LIGA 法（集合光刻、电铸和塑铸）和软刻蚀法[17]。其中最常用的制作方法是模塑法，主要是通过光刻胶得到模具并在模具上固化液态高聚物得到具有微结构芯片的方法，其方法步骤见图1。实验室常采用环氧SU-8 负胶或正胶作为模具，高分子聚合物PDMS 芯片上的微结构则通过模具转移[18]。模塑法与传统的刻蚀、溅射工艺相比，操作简单，形成芯片方便快捷，且设备要求低，是实验室制作芯片的最佳方法[19]。

图1 PDMS 微流控芯片制作示意图Fig 1 Schematic diagram of making PDMS microfluidic chip

键合是芯片制作中的重要环节，微流体通道的封合可采用等离子氧化封接法、阳极键合法、紫外照射法、有机溶剂黏结法和交联剂调节法[20]。由于PDMS 是依靠分子间作用力实现的键合，压力较大时容易出现漏液现象，所以PDMS与玻璃芯片的封接需为永久性。利用等离子氧化处理PDMS 基片和盖板表面，再将两者复合在一起，可以使芯片实现不可逆封接并使封接更为牢固持久。Li 等[21]制作了一种PDMS-玻璃微流控芯片，将浇筑后的PDMS 与表面平整干净的玻璃通过等离子的方法键合在一起，避免了传统玻璃芯片加工时的繁琐，无需刻蚀玻璃。

1.3 微流控芯片结构单元的集成

1.3.1 微泵微阀驱动控制系统 在细胞水平微流控芯片上，借助于微型泵和微阀的流体驱动技术是实现微流体控制的前提和基础，微泵主要包括机械微泵和非机械微泵。机械泵是利用自身机械部件运动或压力作用来驱动微流体的机械动力驱动方式，如气动微泵、压电微泵、流动注射泵、电磁微泵、离心力驱动[22]等；非机械泵是主要靠外场效应实现微流体驱动，其系统本身没有活动的机械部件，包括重力驱动、电渗驱动[23]等。目前绝大部分芯片系统都采用注射泵、蠕动泵等外接流体泵装置来引入试样，对流体的控制精确且稳定，可以执行复杂的程序化操作。

微泵为流体系统提供了动力，微阀则负责控制流体的通断和流动方向，根据是否有动力驱动机构分为有源阀和无源阀[24]。无源阀不需要外部动力制动，利用流体本身方向和压力的变化实现微阀状态的改变，例如舌状阀、隔膜阀及扩散阀。有源阀需要依靠压电、静电、电磁、热气动等机械力进行开合，目前由PDMS 材料制作的气动软薄膜微阀因制动性强，密闭性好，易与其他微流控器件形成集成化最为常用[25]。Unger 等[26]提出了一种采用三层软光刻技术制作的气动PDMS微阀，上层是带有微通道结构的PDMS 芯片，作为气体制动的控制通道；中层为带有通道结构的PDMS 薄膜，作为液体流动通道，下层为玻璃衬底。这种经典气动微阀易于用计算机程序进行控制，便于操作步骤的自动化和芯片功能的集成化，将几个微阀串联起来，按照前后顺序进行开闭，即可驱动流体通道内的液体流动，完成蠕动泵的功能，微阀微泵结构见图2。

1.3.2 浓度梯度生成器 研究表明，细胞因子的浓度与肿瘤细胞的侵袭迁移之间存在着密切的关联[27]，传统的药物浓度梯度实验主要在孔板中进行，利用自动化的液体转移分配机械臂完成对液体的多步操控和试剂运输，并使用多孔板扫描仪或者自动化显微镜扫描拍摄技术对细胞的生存情况进行检测[28]，但由于设备价格高昂，不宜普遍使用。随着微流控技术的深入研究与广泛应用，基于微流体控制原理的浓度梯度技术得到大力发展，比较主流的微流控浓度梯度生成器主要有对流扩散类、基质黏复类、时间演化类、流阻类、并流类等。Jeon 等[29]在微流控芯片上设计并制作了如“圣诞树”结构的溶液浓度梯度生成器，它是由多股液流经过多次的汇合、分流最终形成较为精确的浓度梯度，并且此类构造可以将分析区域与梯度生成区域进行更加精细的空间划分，使梯度环境更加稳定[30]。在芯片中制造浓度梯度用于细胞研究的优势有：通过改变通道构型设计、流体进样流量比、初始浓度设置以及组合顺序，可以获得一系列复杂的浓度梯度[31-32]，简化操作过程，减少了细胞和试剂消耗量，使其在研究肿瘤转移、高通量筛选中发挥重大作用，浓度梯度生成器结构见图2。

图2 微阀微泵及浓度梯度发生器结构示意图Fig 2 Microvalve micropumps and concentration gradient generator

2 微流控芯片在肿瘤研究中的应用

微流控技术凭借着分析速度快捷、样品消耗量小、装置便携化自动化等优势，广泛应用于细胞培养、癌症研究、药物筛选、药物吸收和药物代谢、临床诊断、组织工程[33-34]等领域。

2.1 细胞研究

细胞培养是细胞生物学研究的基石，通过在体外空间模拟体内微环境，配以无菌环境、营养条件、适当温度和pH 值等条件培养细胞，使之生长繁殖并维持结构功能。由于细胞体积微小、种类繁多，且影响因素复杂（如温度、氧气浓度、生物因子浓度、细胞间相互作用、细胞基质间相互作用等），使细胞识别、代谢物检测等细胞研究受到较多限制。微流控芯片因其独特的优势，例如微米级通道与细胞大小相适应，为操纵少数或单个细胞创造条件；集成性强，可以将细胞迁移、捕获等多操作单元集成在一张芯片上，同时也满足了高通量分析需要[35]，从而逐渐应用于细胞培养、细胞分化、细胞迁移、药物代谢[36-37]等多个细胞研究领域当中。

根据培养方式的不同，微流控芯片内细胞培养可分为二维培养和三维培养。二维培养一般用于观察哺乳动物细胞，包含悬浮培养和单层细胞培养两种形式，其优点在于操作简单，易通入培养液且不容易造成通路堵塞，便于进行观察等[38]。但其局限性是模拟细胞体内生长环境能力较差，不能重现细胞与胞外基质、邻近细胞、溶解因子和机械力的相互作用[39]。与二维培养方式相比，三维培养通过长期培养细胞来促进细胞聚集和组织形成，并通过调节相关基因蛋白表达、增殖、分化，从而模拟器官和组织内的细胞外基质环境。三维培养一般是利用水凝胶或胶原蛋白构建支架结构，为细胞提供三维的机械力支持，使细胞在三维情况下对外部环境与刺激做出反应，从而得到更真实可靠的体外模型[40]。

细胞间相互作用在维持生物体的生长功能方面十分重要，微流控芯片技术因其便于实现多种细胞的精确共培养从而被广泛开发并应用于细胞-细胞相互作用的研究中。目前基于微流控芯片的细胞共培养技术已广泛应用于肿瘤转移及分析[41]、抗癌药物筛选、毒性检测[42]等领域，随着该技术的发展，多种细胞共培养芯片模型相继出现，在血管系统和肿瘤研究中得到广泛应用，利用3D 结构和插入膜结构培养上皮细胞、成纤维细胞用于血管生成、肿瘤效应等研究领域；通过微阀、微通道结构培养肿瘤细胞系和免疫细胞用于上皮间充质转化和炎症反应等研究[43]。

2.2 药物筛选

药物筛选是从天然或合成的有机化合物中筛选出高效的先导化合物[44]，并对其进行活性和药理作用的检测，是新药研发的最初过程和关键步骤。由于药物分子库的逐步扩大和药物作用靶点的急剧增加，传统的药物筛选因仪器设备庞大且价格昂贵限制了应用。微流控芯片具有微米级结构和高表面积，其流动模式、传质扩散适用于细胞培养，且具有大规模集有微阀的浓度梯度筛选平台，给新药研发领域带来了新的生机。

根据微流体操控模式的不同，可将微流控药物筛选系统分为灌流模式、液滴模式和微阵列模式[45]。灌流模式培养通过控制流体连续流过微通道，可以保持培养基稳定的输入培养区域，并及时带走细胞代谢产生的废物，为细胞培养提供一个与体内生理环境相似的细胞生长环境[46]。其优势在于操作方便，且适用于光学检测、电化学检测、质谱检测等多种检测方式。Zhang 等[47]通过建立高密度排列的微通道，在不同的集成单元内接种密度不一的乳腺癌细胞，利用微阀控制液流灌注，根据药物筛选的需要向芯片内通入不同类型或不同浓度的药物，并根据肿瘤细胞的迁移速度和比例对药效进行定量分析，实现高通量药物筛选。

液滴模式是近年来在芯片上发展起来的精准操作少量、小体积液体的技术，通常是在芯片中通入两种互不相溶的液体，一种作为连续相，一种作为分散相，在流动过程中连续相对分散相进行剪切，分散相以液滴的形态存在于连续相中，彼此独立，易精确控制[48]。比起灌流模式，液滴模式所需样品量极微，试剂消耗少；每个液滴可以作为独立的反应器，加速试剂混合充分；形成封闭体系，保持液滴内部条件稳定，避免交叉污染等问题，因此该技术广泛应用于药物筛选、细胞操控和单细胞分析等研究领域[49]。为了更好地再现体内肿瘤微环境中各类细胞的相互作用，多种基于三维细胞培养的液滴微流控系统应运而生[50]。Sabhachandani 等[51]利用海藻酸钠凝胶得到含有人乳腺癌细胞和成纤维细胞的肿瘤三维球状体，模拟了各自独立的肿瘤微环境，基于这一液滴阵列，该共培养肿瘤球体对姜黄素和紫杉醇两种抗癌药物进行了细胞毒性检测和分析。基于微阵列模式的药效筛选系统是指在能够适应细胞培养的载体上，构建高密度细胞液滴阵列，并对细胞液滴阵列进行操控和分析[52]。显示出了高通量、低消耗的优势，广泛应用于细胞捕获和细胞分选等。

2.3 药物分析

微流控技术对生物样品的连续处理与实时监测使其在蛋白质和氨基酸分析、肿瘤标志物及癌症研究等生物医学领域都有着重要的应用。蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的体现者，蛋白质磷酸化可以阐明肿瘤相关信号通路，也可以作为药物作用的靶标[53]。目前蛋白质检测技术主要有高效液相色谱、质谱以及酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光法等免疫测定法[54]。这些方法都存在一定的局限性，液相色谱、液质联用等检测方法设备依赖性较高；免疫测定法的灵敏度较低。基于微流控芯片的蛋白质免疫分析技术具有高灵敏检测、即时诊断[55]、规模集成的优势，可以使样品预处理、分离和检测等各种单元技术在微流控芯片上得以实现，因而在分子质量测定、氨基酸序列分析、免疫检测及肿瘤细胞筛选等多个研究领域中得以广泛应用。Lyons 等[56]将特异性抗体（如上皮细胞黏附因子）固定于微流控通道表面，利用荧光反射技术实现对分析物分子的无标记连续检测，通过受体与亲和蛋白结合从而筛选分离出肿瘤细胞，该研究表明人体转铁蛋白受体CD71 可以筛选出许多不能被特异性抗体捕获的癌症亚型。

2.4 仿生研究

随着微流控芯片加工和流体控制技术的日益精湛，以及组织工程、生物材料等前沿技术的发展，仿生微流控器官芯片逐渐成为一个新兴研究领域。器官芯片凭借其方便灵敏、可操作性强、高通量等优势，成为目前适用于进行肿瘤生物学研究的新平台[57-58]。通过在微型芯片上建立能够模拟人体器官主要功能的仿生系统，并加入高通量检测功能，从而使其成为一种高效、可控、能在细胞层次上深刻阐释疾病机制的研究工具。这种技术比起传统的耗时长、不可量化的动物模型更适用于药物筛选、药物安全性分析、理化微环境研究等[59]。目前国内外学者构建了具备关键生理结构及功能的仿生芯片，如仿生肝、仿生肺、仿生肾[60-62]等，并应用于肿瘤学基础研究。通过模拟器官的组织结构与机能，可以高效快速地进行生理机制研究、药理毒理评价以及代谢过程的动态监测。Kong 等[63]以微流控芯片为平台构建了肿瘤肺、肝、骨等多器官转移模型，在芯片模型上考察了肺、肝、骨、骨骼肌等原代细胞诱导的肿瘤转移，结果表明肿瘤细胞趋向于转移至仿生肺、肝、骨等单元，而很少转移至仿生骨骼肌单元。通过仿生芯片模型有助于明确影响肿瘤转移的相关因素，以及筛选抗肿瘤转移药物。

3 展望

微流控芯片因其能将微型、可控的操作单元灵活组合并规模集成的特征以及可以实现高通量多通道平行测试的能力，越来越多地应用于细胞培养、细胞分选等生物学研究和疾病诊断、药物筛选、食品安全等领域。基于微流控芯片的细胞培养技术能够模拟人体微环境进行复杂的代谢和调控，在揭示多细胞生物生理和病理过程中具有重要意义。多学科、多方法结合、多单元集成使微流控细胞培养技术从简单的多细胞模型逐步向类器官的方向发展，在系统级别上模拟多器官的相互作用和生理反应等生物医学方面取得了极大的研究进展，并可通过进一步改进及加强，将新药发掘与筛选与微流控芯片技术相结合，基于芯片平台大量筛选对肿瘤细胞有特异性、非特异性抑制作用的药物，并对其作用机制进行阐明，在疾病分析、发病机制研究、药物筛选以及临床治疗等方面有着良好的应用前景。

虽然微流控技术已取得了飞速的发展和显著的进步，但仍然有很大的发展空间。一方面，目前大多数基于芯片技术的细胞生物学是对传统细胞研究方法的更新与改进，相比微流控技术相对较高的制作要求，生物学家更倾向于选择已成熟且有效的传统技术。因此微流控需要有更好的生物学兼容性，加强多学科人员间的合作；力求在一些研究领域发挥微流控技术的独特优势，比如设备要求较低的即时诊断、生物样品的快速检测以及生理相关性体外模型的构建等，从而加速其在主流细胞研究中的应用[64-65]。另一方面，微流控细胞水平高通量药物筛选尚未达到商品化和通用化的程度，多数系统还难以在超微量和高通量水平下，完成从细胞阵列的形成、培养到加药和检测等全过程操作的自动化[28]。怎样实现细胞的精准量取与分配以及自动快速的高通量筛选结果检测，是下一步在实现微流控药物筛选系统实用化中需要思考的问题。

总之，随着芯片制作技术的不断成熟和各种新型材料的不断开发，微流控技术已经成为细胞生物学研究和细胞分析中非常有力的工具。其未来发展会更倾向于集成化和体内环境模拟的真实化，结合材料、化学、电子工程等不同学科优势，在单个芯片上构成具有多功能集成体系、多复合体系的微全分析系统，并着力于发展细胞的三维共培养技术，从而在微流控芯片内部更好的模拟肿瘤微环境。微流控技术将不断为细胞研究带来革新，进而实现在生物探索、疾病研究、药物筛选、临床治疗等方面的实际应用。