宫腔粘连患者的子宫内膜代谢组学研究*

刘 磊，严思晴，丘甜美，何援利，徐嘉文，蔡慧华，何善阳

[1.广东省心血管病研究所，广州 510080;2.广东省人民医院(广东省医学科学院)妇产科，广州 510080;3.南方医科大学珠江医院妇产科，广州 510280]

宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)是子宫内膜损伤后修复障碍所致的宫腔部分或全部闭塞，常伴月经过少、闭经、不孕、复发性流产等生殖问题[1]。在我国，IUA发病率居高不下，在继发性不孕症中占27.5%～61.5%，在胚胎移植失败中占24.2%～29.1%[2,3]。宫腔镜下宫腔粘连分离术及术后众多的辅助方案能改善IUA患者的宫腔形态，甚至增加或恢复部分患者的月经量，但术后粘连复发和后续的不孕问题使得IUA治疗仍面临着巨大的挑战。研究显示,IUA患者术后复发率高达30%～66%[4]，而总的妊娠率仅为42.8%～66.1%[4]。因此，积极寻求有效的IUA治疗方法，尤其是针对其发病机制的靶向治疗，已成为临床上亟待解决的难题。

目前IUA的发病机制尚未完全明确。最早于1978年有学者发现,IUA的病理特征为子宫壁纤维组织异常增多[5]。之后陆续有越来越多的研究包括本课题组前期工作，证实IUA本质上是子宫内膜纤维化[6-8]。迄今，已有报道小分子代谢物质及其相关通路的变化参与了其他脏器纤维化疾病的发生发展[9-11]，但基于子宫内膜样本的代谢组学分析IUA或子宫内膜纤维化的相关研究则鲜有报道。本研究旨在通过非靶向代谢组学方法探索IUA的潜在标志物，为IUA的发病机制及诊治策略提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年7月至2019年4月在南方医科大学珠江医院确诊为IUA并行宫腔镜宫腔粘连分离术的患者74例(IUA组)。选取同期行宫腔镜检查或宫腹腔镜联合检查且病理确诊子宫内膜无病变的育龄女性患者27例(对照组)。排除标准：(1)病理证实为有子宫内膜组织学改变，如子宫内膜息肉、子宫黏膜下肌瘤、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌；(2)有手术及激素治疗禁忌证，如凝血功能障碍、急性生殖道感染、严重肝肾功能损伤。研究对象均知情同意。

1.2 主要试剂及仪器 甲醇(CAS 67-56-1，LC-MS级，CNW Technologies)、乙腈(CAS 75-05-8，LC-MS级，CNW Technologies)、乙酸铵(CAS 631-61-8，LC-MS级，SIGMA-ALDRICH)、氨水(CAS 1336-21-6，LC-MS级，Fisher Chemical)、超纯水(屈臣氏)、超高效液相仪(型号Vanquish,Thermo Fisher Scientific)、高分辨质谱仪(型号Q Exactive HFX,Thermo Fisher Scientific)、离心机(型号Heraeus Fresco17,Thermo Fisher Scientific)、天平(型号BSA124S-CW,Sartorius)、研磨仪(型号JXFSTPRP-24,上海净信科技有限公司)、超声仪(型号PS-60AL,上深圳市雷德邦电子有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 患者在全身麻醉后接受宫腔镜手术，操作过程中宫腔电切镜外鞘避免接触阴道壁，用环状电切环在不带电状态下轻轻刮取少许内膜组织，将其放在无菌无酶冻存管后迅速投放到液氮罐中储存。

1.3.2 代谢物提取 称取2mg样品，加500μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1(V/V)，含同位素标记内标混合物)；35Hz研磨处理4min，超声5min(冰水浴)；重复3次；-40℃静置1h；将样品4℃，12000r/min离心15min；取上清于进样瓶中上机检测；所有样品另取等量上清混合成质量控制样品上机检测。

1.3.3 上机检测 使用Vanquish超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1mm×100mm,1.7μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含25mmol/L乙酸铵和25mmol/L氨水，B相为乙腈。样品盘温度4℃，进样体积3μL。Thermo Q Exactive HFX质谱仪能在控制软件(Xcalibur，Thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数：Sheath gas flow rate:30 Arb,Aux gas flow rate:25 Arb,Capillarytemperature:350℃,Full ms resolution:60000,MS/MS resolution:7500,Collision energy:10/30/60 in NCE mode,Spray Voltage:3.6kV (positive)或-3.2kV (negative)。

1.4 数据处理 原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cut off值设为0.3。应用正交偏最小二乘判别分析进行建模，并结合单变量和多元变量分析筛选差异代谢物。KEGG注释分析差异代谢物参与的通路，通过富集分析和拓扑分析，筛选出与代谢物差异相关性最高的关键通路。R语言绘制受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)。

2 结 果

2.1 模式识别与差异代谢物分析 正离子模式下，OPLS-DA得分图(图1A)显示：IUA组与对照组分离明显，该模型R2Y=0.594，Q2=0.183；进一步对该模型进行置换检验(图1B)，R2在Y轴的截距为0.500，Q2在Y轴的截距为-0.530，其值小于0。表明该模型不存在过拟合现象，可据此进行差异代谢物的筛选。101个子宫内膜样本中共检测出8197个peak，通过与HMDB数据库匹配，其中633种代谢物被成功鉴定出来。进一步结合单变量及多元变量统计分析，结果显示，其中87种代谢物在IUA患者中呈差异表达。这些差异代谢物包括27种脂质和类脂质分子,24种有机酸及其衍生物,12种有机杂环化合物,8种有机氧化合物,5种生物碱及其衍生物,4种有机含氮化合物,3种苯环型化合物,1种核苷、核苷酸和类似物,1种有机氮化合物,1种有机硫化合物,1种其它。

图1 正离子模式下IUA患者及正常子宫内膜女性的子宫内膜代谢谱A：OPLS-DA得分散点图；B：置换检验图

负离子模式下，OPLS-DA得分图(图2A)显示：IUA组与对照组分离明显，该模型R2Y=0.694，Q2=0.235；进一步对该模型进行置换检验(图2B)，R2在Y轴的截距为0.460，Q2在Y轴的截距为-0.580，其值小于0。表明该模型不存在过拟合现象，可据此进行差异代谢物的筛选。101个子宫内膜样本中共检测出6275个peak，通过与HMDB数据库匹配，其中250种代谢物被成功鉴定出来。进一步结合单变量及多元变量统计分析，结果显示，其中39种代谢物在IUA患者中呈差异表达。这些差异代谢物包括12种脂质和类脂质分子,12种有机酸及其衍生物,4种核苷、核苷酸和类似物,4种有机氧化合物,3种苯环型化合物,3种有机杂环化合物,1种苯丙烷和聚酮化合物。

综上，由于两组间的肌酸酐水平在正、负离子模式均存在差异，即正、负离子模式的差异代谢物存在1种重复代谢物，因此总离子模式共有125种差异代谢物。设定多元变量统计分析参数P<0.01，VIP(差异贡献值)>1且FC(倍数变化IUA vs Control)>3或<0.33，最终筛选出10种具有潜在生物标志物作用的差异代谢物。与对照组相比，IUA组子宫内膜的3-甲基戊二酰肉碱(3-Methylglutarylcarnitine,3-MGC)、氟硅唑、L-辛酰肉碱、二甲基二烷基氯化铵、癸酰肉碱、赖氨酰-羟脯氨酸、二氢-2,4,6-三(2-甲基丙基)-4h-1,3,5-二噻嗪、L-己酰肉碱、丙酰肉碱(propionylcarnitine,PC)以及邻苯二甲酸二丁酯均表达上调(表1)。

2.2 差异代谢通路分析 正离子模式下，IUA组与对照组在组氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，β-丙氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，氮代谢，D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢，亚油酸，氰基氨基酸代谢，氨酰tRNA生物合成，泛酸和辅酶A生物合成，赖氨酸生物合成，丁酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，色氨酸代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，嘌呤代谢，卟啉与叶绿素代谢等21条代谢通路途径差异有统计学意义(表2)。

负离子模式下，IUA组与对照组在嘧啶代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，丙酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环，精氨酸和脯氨酸代谢，嘌呤代谢，β-丙氨酸代谢，戊糖磷酸途径，谷胱甘肽代谢，丁酸代谢，烟酸和烟酰胺代谢，脂肪酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代谢，淀粉和蔗糖代谢，酪氨酸代谢，类固醇激素生物合成等17条代谢途径差异有统计学意义(表2)。

经富集分析，10种潜在生物标志物的差异代谢物均未找到上述相应的代谢通路。考虑我们分析通路使用的数据库是KEGG数据库(目前国际上通路信息最大的数据库)，若这个数据库没有收录这些物质的通路信息，则做不了通路分析；但并不代表这个物质不存在或者没有功能。鉴于KEGG数据库的更新可能有滞后，所以下一步需要结合文献检索来分析这10种潜在生物标志物的差异代谢物的相关信号通路和功能。

表2 IUA患者与正常子宫内膜女性的子宫内膜差异代谢通路

2.3 ROC诊断模型的建立 10种潜在生物标志物的差异代谢物中，有4种物质用于诊断IUA的曲线下面积(area under the cure，AUC)>0.70，分别为赖氨酰羟脯氨酸(AUC=0.793)、丙酰肉碱(AUC=0.789)、氟硅唑(AUC=0.731)、3-MGC(AUC=0.743)。其中，赖氨酰-羟脯氨酸、PC联合3-MGC或氟硅唑诊断IUA可达到最大效能，AUC均高达0.846(表3)。

3 讨 论

IUA作为纤维化病变，其主要病理基础是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成与降解的动态失衡，促使ECM过度沉积[12]。ECM蓄积过程中必然伴随着代谢物质及其相关通路的变化[13]。现阶段能对机体分泌的代谢物进行整体性分析的技术被称为代谢组学。其中，非靶向代谢组学主要是寻找差异代谢物，解释差异代谢物在其参与的代谢通路中所执行的生物学功能，从而为疾病的诊断和机制研究提供参考。近年来，子宫内膜组织基于代谢组学的生物标志物和机制研究的探索主要集中在子宫内膜癌、子宫内膜异位症及不孕症患者的子宫内膜容受性方面[14-16]，其在IUA的应用尚处于空白阶段。本研究首次通过101例IUA患者和正常女性的子宫内膜非靶向代谢组学分析，成功筛选得到10种差异代谢物和38条差异代谢途径。其中，IUA患者子宫内膜的3-MGC、氟硅唑、L-辛酰肉碱、二甲基二烷基氯化铵、癸酰肉碱、赖氨酰-羟脯氨酸、二氢-2,4,6-三(2-甲基丙基)-4h-1,3,5-二噻嗪、L-己酰肉碱、PC以及邻苯二甲酸二丁酯水平较正常子宫内膜女性明显上升。并且，经ROC曲线分析建立联合诊断模型，认为3-MGC或氟硅唑联合赖氨酰-羟脯氨酸和PC的诊断效能最佳，有望作为IUA的诊断标志物，有望为IUA的诊治策略和机制研究提供新方向。

3-MGC作为脂肪酰基肉碱之一，主要参与脂肪酸的β-氧化。首先，脂肪酸氧化是指油脂在充足的氧气供应条件下水解产生的甘油和脂肪酸，进而产生二氧化碳和水，释放出大量能量供身体使用。而脂肪酸的β-氧化是脂肪酸氧化的常见形式之一。在脂肪酸β-氧化过程中，第一步是脂肪酸被细胞液中的乙酰辅酶A激活为脂肪酸酰辅酶A。之后脂肪酰辅酶A被肉碱运输到线粒体中，进行β氧化，最终产生乙酰基辅酶A和脂肪酰基肉碱[17-18]。有研究报道，脂肪酰基肉碱在心肌中的积累可抑制脂肪酸的氧化，并产生一些有害作用[19]。随后有研究证实，急性冠脉综合征患者存在脂肪代谢紊乱，其中尿液3-MGC为主的脂肪酰基肉碱水平明显升高，有助于提高疾病的诊断效率和准确率[20]。众所周知，急性冠脉综合征是以冠脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发闭塞性血栓形成为病理基础的临床综合征，可继发心室重构和心肌间质纤维化[21]。除了心肌纤维化，在肝纤维化方面，Mann等[22]在多中心队列人群中发现，非酒精性脂肪肝相关的肝纤维化患者外周血1449种代谢物中，高水平的3-MGC与多种等位基因变异的个体风险相关，其中携带PNPLA3和HSD17B13等位基因的风险增加，而携带HSD17B13的风险减少。以上研究高度提示高水平3-MGC与纤维化疾病的发生相关。本研究亦发现，IUA患者子宫内膜组织中3-MGC蓄积，可能参与子宫内膜纤维化形成，后续需验证其具体关系和机制。

氟硅唑是一种三唑类杀菌剂，主要通过破坏和阻止麦角甾醇的生物合成限制细胞膜的形成，最终引发病菌死亡，因此被广泛应用于防治各种农作物的真菌感染[23]。然而，氟硅唑在人类健康和疾病方面的研究颇少。仅Karacaoglu等[24]通过体外实验发现，氟硅唑可引起男性生育能力低下，其作用机制与细胞毒性、氧化应激受损、脂质代谢失调有关。氟硅唑在人体纤维化疾病或子宫内膜方面的研究，国内外尚无报道。本研究首次发现，IUA子宫内膜纤维化患者中氟硅唑呈上升趋势，且差异贡献值和诊断IUA的效能一致，仅次于3-MGC。后续可通过体外研究其对子宫内膜间质细胞的细胞毒性、氧化应激及脂质代谢情况揭示其可能机制。

PC属于酰基肉碱，是肉碱与氨基酸或脂肪酸代谢物结合的一类酯类物质。其主要参与细胞内的能量代谢，尤其是线粒体内脂肪酸的β-氧化过程，在间歇性跛行、心血管疾病、糖尿病等方面均有相关报道[25-27]。Silvestro等[25]报道，在间歇性跛行患者中，踏车运动可引起急性内皮功能恶化和血浆黏附分子浓度增加，而静脉注射PC可有效预防这些损害。Broderick等[26]发现，PC可通过影响线粒体的丙酮酸代谢改善糖尿病和缺血性心脏病大鼠的心脏代谢和功能。李蕾等[27]则检测到2型糖尿病大鼠血清PC高表达，通过运动干预3个时间点均能有效下调PC和血糖水平。提示PC在不同疾病或疾病的不同阶段存在差异，并非绝对起保护作用。本研究亦发现，IUA患者子宫内膜组织中PC高表达，可能参与子宫内膜纤维化的发生。迄今，PC在其他脏器纤维化疾病中的表达鲜有报道，因此仍需扩大子宫内膜临床样本量及分层分析进行验证其在组织纤维化中的作用。赖氨酰-羟脯氨酸是在IUA患者中具有潜在诊断标志物的代谢物，目前尚无文献报道，有待进一步验证。

综上所述，IUA患者表现出有别于正常女性的子宫内膜代谢谱特征。本研究筛选得到的4种差异代谢物组合，即3-MGC或氟硅唑联合赖氨酰-羟脯氨酸和PC，有望作为诊断IUA的潜在标志物，后续仍需扩大样本量及开展临床前实验进行验证。