SN-38脂质体的制备及质量评价的研究

姜 红，苏可欣，石 凯

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

作为喜树碱类新药伊利替康（CPT-11）在体内被羧酸酯酶转化的活性代谢产物，7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）具有更强的药理活性和抗肿瘤增殖作用[1-2]。研究表明 SN-38 通过选择性抑制拓扑异构酶 I（TOPO I）而干扰 DNA 的复制，具有高效低毒、广谱抗癌的特点，可用于头颈部肿瘤、白血病、肝癌、胃癌、膀胱癌、直肠癌及卵巢癌等各种恶性肿瘤的治疗[3-4]。但由于 SN-38 具有水不溶、脂难溶的溶解性质，较差的成药性限制了其在临床上的广泛应用。虽然可以通过碱化开环增加水溶性，但活性只有闭环形式的 1/10[5]。国外研究人员对 SN-38 进行了结构改造，制成了以 CPT-11 为代表的水溶性衍生物或前体药物，使其水溶性有了较大提高，但在体内的酶转化率较低（＜ 10%），导致临床治疗的个体差异较大。其他处于研究中的剂型有脂质体、乳剂以及聚合物纳米粒等，这些给药系统均以保护 SN-38 内酯环为目的，但由于载药量、稳定性等原因至今仍无相关产品应用于临床[6]。

对于以上新剂型的选择方面来讲，脂质体制剂是目前喜树碱类衍生物抗癌药物的研究热点之一。脂质体是利用磷脂双分子层膜所形成的囊泡包裹药物分子而形成的给药系统，是一种具有定向作用的药物载体，属于靶向给药系统的一种新型制剂形式[7]。其进入体内后易被网状内皮系统（如肝、脾、骨髓等）所摄取，巨噬细胞把其作为外来异物进行吞噬、降解[8]，而后其迅速进入溶酶体内消化，达到释放药物的目的；这一系列反应，可使药物在这些靶组织中维持较高浓度，从而以提高药物生物利用度达到提高药物疗效的目的[9]。此外，脂质体还具有可生物降解、无毒、无免疫原性、减少给药剂量、降低毒副反应、具有一定长效作用等优点，深受广大研究者的喜欢。

因此，本研究选用薄膜法制备 SN-38 脂质体，结合 HPLC 法建立了 SN-38 脂质体包封率的测定方法，以包封率和载药量为评价指标，采用因素考察法来考察胆固醇含量、磷脂含量和药物浓度以及制备工艺中如水化时间、水化温度等因素对包封率的影响，从而选出最优处方并对其进行相关体外评价，为其质量控制以及后续研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BS110S 电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ-100 型超声波清洗器（江苏省昆山超声仪器厂）；旋转蒸发仪（上海市亚荣生化仪器厂）；SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；高效液相色谱仪、LC-10AT 型泵、SPD-M10A VP 紫外检测器（日本岛津）；752-紫外光栅分光光度计（上海市第三分析仪器厂）；FD-1型冷冻干燥机（北京博衣康实验仪器有限公司）。JEM-1200EX 透射电镜（日本电子株式会社 JEOL）；LS 230 型激光粒度测定仪（美国贝克曼 Beckman-Coulter 公司）；SHA-B 恒温振荡器（常州国华电器有限公司）。

1.2 试药

7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38，纯度 ＞ 98%，安耐吉化学）；蛋黄卵磷脂 PL-100M（注射级，艾伟拓医药科技有限公司）；胆固醇（注射级，艾伟拓医药科技有限公司）；蔗糖（天津市化学试剂公司）；乳糖（天津市科密欧化学试剂公司）；葡萄糖（天津市化学试剂公司）；海藻糖（日本旭化成）；甘露醇（天津市科密欧化学试剂公司）；甲醇（色谱纯，天津市康科德试剂公司）；无水乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂厂）；实验用水为纯化水，脂质体样品为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 SN-38 体外分析方法的建立[10]

2.1.1 检测波长的确定

精密称取 SN-38 适量，以甲醇溶解并稀释成浓度为 10 μg/mL 的待测液，以适量的甲醇溶液为空白，在 200～400 nm 波长范围内进行紫外扫描。扫描结果显示，SN-38 在 266 nm 和 384 nm 均显示出最大吸收，且两处吸收强度较为相近。综合考虑远紫外区所受干扰相对比较小，因此选择 384 nm 作为 SN-38 的检测波长。

2.1.2 色谱条件

采用 RP-HPLC 法测定，具体条件为：色谱柱，Diamonsil TM C18 ODS（200 × 4.6 mm, 5 μm）；流动相，0.05 mol/L 醋酸铵缓冲液（pH6.4）-甲醇（40 : 60, v/v）；检测波长，384 nm；流速，0.8 ml/min；柱温，35 ℃；进样量，20 μl。

2.1.3 样品溶液的配制

精密称取 SN-38 5.0 mg，用 DMSO 进行溶解后定容至 25 mL 量瓶中，配成 0.2 mg/mL 的标准贮备液；量取贮备液50 μL，分别用甲醇和 0.1 mol/L NaOH 稀释制成1.0 μg/mL 的内酯型（LSN-38）及羧酸盐型（C-SN-38）样品溶液。再次精密量取贮备液 50 μL，用其中含有空白脂质体且 pH 为 7.4 的 PBS 缓冲液稀释制成浓度为 1.0 μg/mL 的溶液，37 ℃ 保温 1 h 作为水解样品。

2.1.4 专属性试验

在上述色谱条件下，分别取内酯型、羧酸盐型、水解样品以及空白脂质体的 PBS 缓冲液（pH7.4）20 μL 进样，记录色谱图（见图 1）。

Fig. 1 HPLC chromatograms of blank PBS containing blank liposomes (a); C-SN-38 (b); L-SN-38 (c) and Hydrolysis samples. Park1- C-SN-38; Park2- L-SN-38 图 1 空白脂质体PBS缓冲液色谱图 (a)、内酯型(b)、羧酸盐型(c)以及水解样品(d)

结果表明，在此种色谱条件下，SN-38 的内酯型（L-SN-38）和羧酸盐型（C-SN-38）峰形均较为良好，可以达到基线分离（分离度4.3 ＞ 1.5），其保留时间分别为 7.6 min 和4.4 min，且辅料不干扰测定。

2.1.5 标准曲线

分别精密吸取上述标准贮备液 5、25、50、250、500 μL 至 10 ml 量瓶中，用甲醇稀释成浓度为 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL 标准溶液。进样 20 μL，以峰面积（A）对浓度 C（μg/mL）进行回归，得回归方程为：A = 115227C + 4344.0；其线性关系良好（r = 0.999 9, n = 3），线性范围为 0.1～10 μg/mL。

2.1.6 回收率试验

分别精密量取 SN-38 标准贮备液 5、50、500 μL 于 10 mL 量瓶中，加入处方量要求的空白脂质体适量后用甲醇稀释至刻度，进样 20 μL，测得样品的平均回收率在 98%～102% 之间，RSD 值均小于 2%，符合试验要求。

2.1.7 精密度试验

取标准曲线制备中的低（0.1 μg/mL）、中（1.0 μg/mL）、高（10.0 μg/mL）三个浓度的 SN-38 标准液，每个浓度的样品分别测定 3 次后，记录峰面积。一日中同一种样品测定 5 次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）作为日内差异；另选择同一样品连续测定 5天，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）作为日间差异，RSD 值均小于 2%，符合要求。

2.1.8 溶液稳定性考察

取“2.1.5”项下浓度为 1.0 μg/mL 的待测溶液，分别于配制后 0、2、4、6、8 h 进样20 μL，记录峰面积。计算相对标准偏差结果表明，SN-38 的峰面积在 8 h 内变化不明显且未见降解产物及开环峰，相对标准偏差均 ＜ 2%，表明 SN-38 溶液在 8 h 内相对稳定。

2.2 SN-38 脂质体的制备及包封率、载药量的测定

2.2.1 SN-38 脂质体的制备[11]

依照处方对应量，精密称取脂质体材料和主药，加入适量体积的氯仿充分溶解后，置于250 mL茄形烧瓶中，40 ℃ 条件下旋转蒸发除去溶剂，放置与室温相同后，置于真空干燥器中 48 h，除尽残留的氯仿液，从而得到均匀透明的脂质膜。取得到的样品适量，加入适量的水化介质，一定温度的条件下，常压旋转清洗样品，得到无粘块较为均一的白色混悬液适量，将其在冰浴条件下进行探头超声，其功率为 200 W，超声时间为 3 min，频率为 3 s on、3 s off。超声完成后，得到的混悬液淡蓝色、有乳光，用无菌注射器抽取适量，选择 0.45 μm 微孔滤膜过滤，完全除去金属残屑后，放置于 4 ℃ 条件下密封保存。

2.2.2 包封率测定

精密量取脂质体混悬液 0.2 mL置于 5 mL 量瓶中，加入适量甲醇溶液超声破乳操作后，继续用甲醇稀释至刻度，按“2.1.2”项下色谱条件检测样品的峰面积，计算总的药物含量（CT）。再次精密量取 0.2 mL 脂质体混悬液，添加于 Sephadex G-25 凝胶微柱的顶端，2 000 r/min 离心 3 min 后，再加入 0.2 mL 蒸馏水；2 000 r/min 条件下离心 3 min 洗脱，重复此操作 2 次后收集各次洗脱液，置于 5 mL 量瓶中，用适量甲醇溶液洗涤后转移、超声破乳，再次用甲醇溶液稀释至刻度，按“2.1.2”项下色谱条件检测样品的峰面积，并计算药物的浓度（CI）。根据下式计算包封率 EE% 和载药量 DL%。

式中，CI—表示包封在脂质体中的 SN-38 浓度；CT—表示脂质体混悬液中 SN-38 的总浓度。

2.2.3 载药量的测定

精密吸取脂质体混悬液 0.2 mL，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶液适量，超声 3 min使溶液澄清，再用甲醇溶液稀释至刻度。按“2.1.2” 项下色谱条件测定样品峰面积，代入“2.1.5”项下曲线，计算脂质体中药物含量。

2.3 SN-38 脂质体的处方优化[12]

固定制备工艺为：水化介质 PBS 的 pH 为 6.5，水化时间选择 60 min，水化温度选择 60 ℃，单因素考察处方工艺即药质比及胆固醇用量对包封率和载药量的影响。

2.3.1 磷脂与药物质量比

处方工艺中固定磷脂（PC）与胆固醇的比例为 3 : 1，磷脂与原料药的比例分别为 10 : 1、20 : 1、40 : 1，按“2.2.1”项下工艺制备脂质体后测定其包封率和载药量，结果见图 2。

Fig. 2 Effects of PC/SN-38 weight ratio on drug recovery (E.E) and drug loading (D.L)（n = 3） 图 2 磷脂/SN-38质量比对药物回收率和载药量的影响（n = 3）

结果显示，药脂比对脂质体的包封率和稳定性有着直接影响，原料药比例过大，则磷脂的承载能力会大打折扣，最终无法形成既稳定又达标的脂质体。当药脂比为 1 : 10 时，包封率达到 53.2%；增加磷脂用量，使药脂比达到 1 : 20 时，包封率则为 90.28%，载药量 3.4%；磷脂用量继续增大时，则不能明显增加脂质体的包封率，相反的会降低载药量，因此选择磷脂与药物质量比为 20 : 1。

2.3.2 胆固醇用量

处方工艺中固定磷脂与药物的质量比（20 : 1），改变胆固醇的加入量为 0%、10%、20%、30%、40% 时，按“2.2.1”项下方法制备脂质体后测定包封率和载药量，结果见图 3。

Fig. 3 Effects of cholesterol weight ratio on drug recovery (E.E) and drug loading (D.L)（n = 3） 图 3 胆固醇质量比对药物回收率和载药量的影响（n = 3）

结果显示，随着胆固醇用量的逐渐增加，相应的，其包封率也随着增加。研究发现，选用适量的胆固醇能够使双分子膜的刚性增加，从而降低其流动性，最终在一定程度上使其包封率相对增加。但是当胆固醇的用量超过 30% 时，包封率反而有降低的趋势。推测可能是由于脂溶性药物和胆固醇竞争性的进入到双分子层空间十分有限，产生了较为明显的竞争性的抑制作用。与此同时，胆固醇分子能够明显的对磷脂双分子层膜的流动性产生影响，药物在水化过程中向脂质体的转移产生了障碍，大量的胆固醇分子的存在会显著降低其包封率。综合其他影响因素考虑，最终确定胆固醇的加入量为 20%。

2.3.3 水化温度

在处方工艺中固定其他条件不变，分别选择水化温度为 40 ℃、50 ℃、60 ℃，制备相应的脂质体，测定该脂质体的包封率和载药量，结果见图 4。

Fig. 4 Effects of temperature of hydration on drug recovery (E.E) and drug loading (D.L)（n = 3） 图 4 水化温度对药物回收率和载药量的影响（n = 3）

结果显示，随着水化温度的升高，包封率略有增加。水化温度高于 60 ℃ 时，磷脂在高温时易发生氧化变质现象，故最终确定最佳的水化温度为 60 ℃。

依照以上优化后的制备工艺，制备 3 批脂质体，最终测定其包封率的平均值为（91.28 ± 3.27）%，载药量为（3.65 ± 0.21）%。

2.4 SN-38 脂质体冻干制剂的制备

2.4.1 冻干工艺

吸取所配样品 2 mL 置于 10 mL 西林瓶中，放入 -20 ℃ 低温冰箱，12 h 后快速取出，放入冷阱温度已降至 -50 ℃ 的冷冻干燥机的搁板上，加盖真空罩，真空泵开关置于开始状态，冻干 24 h。结束后在冻干室内选用加塞系统使上部搁板下降的方法把瓶塞压紧。注意以上操作均需在避光条件下进行。

2.4.2 冻干保护剂种类的筛选

分别选用葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖和甘露醇做冻干保护剂，分别加入脂质体混悬液中，使其充分溶解后选用冷冻干燥法制备 SN-38 脂质体冻干粉针。分别加入质量分数为10% 的不同种类的冻干保护剂或不加保护剂，以冻干后粉末的状态、水化后再分散的难易程度以及粒径大小为相关评价指标，对冻干保护剂的种类进行初步选择。

Table 1 The influence of additives on the characteristics of freeze-dried powder 表 1 冻干保护剂对冻干粉特性的影响

结果显示，相对于其他种类的冻干保护剂，选择加入质量分数为 10% 的蔗糖，能得到疏松、平整的粉末，且水化容易，水化复溶后粒径无明显变化，综合其他因素，最终选择质量分数为 10% 的蔗糖为保护剂制备脂质体的冻干制剂。

2.5 脂质体的质量评价研究[13]

2.5.1 外观

新制备的 SN-38 脂质体为淡蓝色近澄明溶液，肉眼观察未见不溶性成分或块状团聚物，显微镜下观察无维甲酸结晶析出，结果见图 5。

Fig. 5 The appearance of liposome suspension 图 5 脂质体混悬液外观

2.5.2 形态观察

选用透射电子显微镜对脂质体的形态进行相关评价，方法如下：取自制的脂质体混悬液适量，加蒸馏水 10 倍进行稀释，取适量脂质体混悬液滴至透射电镜的铜筛网上，选用 2.0% 磷钨酸钠液染色 3 分钟，用滤纸缓慢吸干多余的液体后，用透射电镜仔细观察其形态，拍摄照片留存，结果见图 6。

Fig. 6 Transmission electron microgram of SN-38-loaded liposomes 图 6 SN-38 脂质体透射电镜照片

2.5.3 粒径大小及分布

在室温条件下，取适量脂质体混悬液，用水稀释到适当的浓度，加入到 LS 230 型激光粒度仪的样品池中，测定粒径大小及分布情况，见图 7。

Fig. 7 Particle diameter and size distributions of SN-38-loaded liposomes 图 7 SN-38 脂质体的粒径和尺寸分布

结果显示，所制备的脂质体平均粒径为 145 ± 23 nm，粒度分布 D90/D10为 1.5，粒径均呈现均一的单峰分布现象。

2.5.4 体外释放度的测定研究

精密量取新制备的脂质体混悬液 0.5 mL，放于预先处理好的透析袋中，系紧透析袋两端后置于 100 mL 锥形瓶中，加入 9.5 mL 透析介质。将锥形瓶放入温度为（37 ± 0.5）℃的恒温的摇床中，选择频率为 50 r/min 振荡，于预定时间将透析介质全部取出，更换相应的新鲜介质 9.5 mL，继续操作。将取出的介质分为 2 份，一份立即进样 20 μL 于 HPLC 仪内测定内酯峰面积；一份加入磷酸，混合均匀后避光放置 8 h，使样品充分酸化后，进样20 μL于 HPLC 内测定内酯峰面积。色谱条件与“2.1.2”项下条件相同，结果见图 8 和 9。

Fig. 8 The cumulative release of lactone and carboxylate of liposomal SN-38 in varied pH buffer media at 37℃ 图 8 不同pH缓冲液中内酯型和羧酸型 SN-38 脂质体的累积释放量（37 ℃）

Fig. 9 The cumulative release of liposomal SN-38 in varied pH buffer media at 37℃ 图 9 不同的pH缓冲液中 SN-38 脂质体的累积释放量（37 ℃）

由上图可知，脂质体样品在 3 h 内总释药量小于 12%，说明脂质体渗漏的很少。我们可以推断出脂质体中内酯型开环水解速率不受脂质体释药速率影响。根据相关文献报道发现，OH-可渗入脂质双分子层，诱发 SN-38 发生原位开环现象，因此我们推断脂质体包裹的 SN-38 开环后仍封闭在脂质体内部。

3 讨论

常见的脂质体制备方法主要分为以下几种：薄膜法、溶剂注入法、硫酸铵/pH 梯度法及逆相蒸发法等[14]。选择的制备方法不同，脂质体的粒径及对药物包封率相应的也会不同。通过参考大量文献、比较分析各种制备方法，本文最终选用薄膜法作为 SN-38 脂质体制备的方法。实验中采用低速离心法分离脂质体与未包裹药物，选用 HPLC 法建立了 SN-38 脂质体包封率的测定方法。以包封率和载药量为评价指标，考察了胆固醇含量、磷脂含量和药物浓度以及制备工艺因素如水化时间、水化温度对包封率的影响，从中选择出最佳的制备工艺。其次，由于脂质体在贮存期间会发生不稳定现象，故将脂质体进行冷冻干燥后保存。

脂质体制剂属于胶体给药系统，在储存过程中会发生絮凝、聚集、分层、粒度增大、药物渗漏等相关的不稳定现象，因此在实验中选择冻干的方式把脂质体制成相对稳定的制剂。脂质体冻干后的产物是干燥、具有良好流动性能的粒状物，加入水后就会形成脂质体混悬液，在临床中可用于静注及各种给药途径。但是，脂质体在冻干过程中损耗的发生是不可避免的，为了减少在冻结过程中对冻干脂质体产品质量的影响，控制冻干前后脂质体的粒径，研究脂质体在含有不同保护剂以及不同保护剂浓度时、冻干脂质体粒径变化的发生就显得十分有必要。

目前 SN-38 临床应用的主要问题是：不溶于水并且很难溶于常见有机溶剂，而选择制成水溶性钠盐注射液后抗癌活性大幅降低；其制剂稳定性差，制剂中酚羟基对光、热敏感；碱化后的羧酸盐极性变大，体内代谢消除变快，在临床上就要持续静注给药，从而引起患者顺应性差的现象发生。若把 SN-38 制成脂质体后，则能提高 SN-38 表观水中溶解度；其次脂质双层的保护作用，能提高α-羟基内酯环的完整性和稳定性，从而提高药物的药理活性，延长药物在体内的停留时间，增加了药物与细胞的亲和力，使药效发挥更好[15]。SN-38 不溶于水，也难溶于有机溶剂，但研究发现其与磷脂有一定的亲合作用，采用先制备药物—磷脂膜，再进行水化的方法制备脂质体，则会显著增加其疗效。大部分水不溶、脂难溶性药物在制备成脂质体后，放置过程中容易发生药物渗漏；因此，把脂质体混悬液冷冻干燥制成前体脂质体，以干燥粉末的形式存在，可有效避免磷脂水解和防止药物渗漏现象的发生。