博莱霉素对小麦的诱变效应研究

张希太,肖磊,董策,路其祥

（邯郸市农业科学院生物技术研究室,河北 邯郸 056001）

基因突变育种是小麦遗传改良、种质资源创新与新品种培育的重要途径,是对常规杂交育种技术的重要补充和不可缺少的育种手段.化学诱变技术具有成本低廉、使用方便、诱变作用专一等特点[1],化学诱变剂及诱变方法的选择对化学诱变的成功与否至关重要.近半个世纪以来,各国学者曾试用许多化学物质来筛选有效低毒的化学诱变剂[1].博莱霉素（Zeocin）是世界卫生组织确定的用于治疗部分癌症肿瘤的抗生素,其治疗原理与我国的平阳霉素基本相同,都是通过干扰阻止肿瘤细胞的DNA 复制来达到抑制肿瘤生长目的.平阳霉素是中国医学科学院抗菌素研究所与华北制药厂从浙江省平阳县采集的土壤中分离培养出的一种轮支链霉菌变种（Str.Verticillusvar Pinyanagensis n.var）产生的由10 余种成分复合而成的抗生素,经药物分析研究,平阳霉素中因含有博莱霉素的A2、A5、B2成分而在临床上具有治疗癌症肿瘤的效果[2-3].

在平阳霉素的应用过程中,我国科技工作者又发现了它对微生物、哺乳类动物、植物的染色体都有强烈的诱变作用,并逐渐应用于部分植物的诱变育种[4-6].朴铁夫等[7]1998 年开始平阳霉素诱变小麦的研究.前人用平阳霉素诱变小麦的方法主要有以下几种:种子处理法,1994 年和1998 年朴铁夫等在20 ℃下,先将“吉麦2 号”小麦种子用自来水浸泡12 h 后,再在质量浓度分别为10 μg/mL、30μg/mL、50μg/mL 剂量的平阳霉素溶液中浸泡12 h,然后水洗2 h,晾干后进行播种[8-9],研究了平阳霉素质量浓度对M1 代根长、根数、苗高、出苗率、根尖细胞染色体畸形率及M2 代突变率的影响并和EMS 诱变作比较.花粉管通道法,1997 年孙德全等[10]、2011 年张希太等[11]在小麦扬花期利用花粉管通道将平阳霉素溶液渗透到“龙辐麦3 号”“豫麦66”的胚囊诱变合子或幼胚.孙德全试验表明,平阳霉素有较强的诱变效应,不同质量浓度处理对小麦的诱变效果不同,75μg/mL 时变异率较大并获得了一些优异突变株.张希太试验表明,平阳霉素能够使小麦在株高、蜡质层、芒型、穗型、叶绿素含量、生育期等方面产生变异,在0~50μg/mL 质量浓度范围内,随着平阳霉素质量浓度的提高对小麦的诱变效应增强,选出了2 个变异种质系并对诱变母体材料和变异种质系的基因组DNA 进行了SSR 分子标记检测与分析,在变异种质系基因组中检出了丰富的变异位点.培养基添加法,1998 年顾德峰等[12]将平阳霉素添加入小麦幼胚离体培养的培养基中,研究了平阳霉素对小麦幼胚愈伤组织发生及其植株再生的影响.结果表明:在20℃下,采用不同质量浓度的平阳霉素处理幼胚长度为1.0～1.5 mm 的幼嫩麦粒8 h,然后用蒸馏水洗净,在超净工作台上用升汞灭菌后剥取1.0～1.5 mm 的幼胚接种到MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.5mg/L+CH 200mg/L 固体培养基上,形成愈伤组织,愈伤组织在MS+KT 0.2 mg/mL 的培养基上分化出幼苗,10～40μg/mL 的平阳霉素可作为对小麦幼胚外植体离体培养时的适宜诱变浓度.穗茎注射法,1999 年孙德全等[13]研究了在小麦开花期将不同质量浓度的平阳霉素溶液通过穗茎注入小麦“龙辐麦3 号”体内的诱变方法.结果表明:“龙辐麦3 号”在株高、穗长、小穗数、主穗粒数、千粒质量等方面发生变异,M1代随平阳霉素质量浓度的提高生理损伤加大,100μg/mL的平阳霉素处理M2代变异率较大.叶脉注射法,2002 年张秋英等[14]在小麦孕穗初期对“晋麦2148”“福繁17”和“绵阳35”进行叶脉注射平阳霉素溶液的诱变研究.结果表明:在3 个品种的M2代均出现了明显的矮秆、熟期、籽粒颜色等性状变异;这些变异在不同遗传背景的品种处理中出现的类型不同,频率也有差异;经M2代选择后,在M3代绝大多数变异株系的穗长、穗粒数、千粒质量等变异性状已能稳定遗传,而有部分株系的株高和熟期两个变异性状仍在分离.分蘖节（生长点）注射法,2011 年张希太等[15]在小麦苗起身后拔节之前将0~50μg/mL 不同质量浓度的盐酸平阳霉素溶液通过叶鞘注射到小麦品种“兰考矮早8”的生长点（分蘖节）部位,对平阳霉素的诱变效果进行了研究.其后代在株高、蜡质层、芒型、穗型、叶绿素、生育期等几个方面发生大量变异,通过对变异后代的系统选择得到了pyms-6、pyms-2 两个种质系.通过对“兰考矮早8”及两个种质系pyms-6、pyms-2 基因组DNA 的SSR 分子标记检测,在变异种质系基因组中检出了丰富的突变位点.

平阳霉素用于诱变育种已多有报道,然而未见博莱霉素应有于诱变育种的研究.本研究进行了“小麦种子在不同质量浓度的博莱霉素溶液中萌发生长”的诱变方法,对“济麦22”种子进行诱变处理,直至对照处理培养皿苗长成2 叶幼苗止.每天利用不同质量浓度的博莱霉素溶液进行诱变研究,旨在探讨博莱霉素对小麦是否有诱变效应及合适的诱变剂量和诱变方法.

1 材料与方法

1.1 试验材料

诱变的母体材料为“济麦22”种子,取自于邯郸市农业科学院生物技术研究室的育种试验材料圃;诱变用的博莱霉素试剂从赛默飞世尔科技（中国）有限公司购买.

1.2 诱变方法

1.2.1 诱变适期 为了使诱变后的培养皿苗尽快在试验田中移栽,诱变时期一般选在秋季小麦大田播种前一个月（9 月份）进行.

1.2.2 博莱霉素的处理质量浓度 用无菌自来水配制0 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL 不同质量浓度的博来霉素溶液.

1.2.3 诱变材料的准备 选取籽粒饱满、完整、健康无病害的“济麦22”种子,先用自来水冲洗去表面的灰尘,然后浸入1 mg/mL 质量浓度的升汞（HgCl2）溶液灭菌8~10 min,用无菌水反复冲洗灭菌后的种子5~6次备用;将21 套培养皿用无离子水煮沸灭菌后备用,分别在培养皿中均匀放入灭菌后的“济麦22”种子100 粒.

1.2.4 博莱霉素的处理方法 每天上午8:00 在培养皿中加入不同质量浓度的博莱霉素溶液5 mL,至液面埋没种子的一半为宜,每个博莱霉素质量浓度处理重复3 次.从第二天起每天上午8:00 观察培养皿中的博来霉素溶液量,如发现溶液量减少及时补足相应质量浓度的博来霉素溶液;种子萌发长成的幼苗顶培养皿盖时,去掉该处理的培养皿盖.为防止去掉盖后培养皿中的水分过度蒸发造成博来霉素溶液质量浓度出现偏差,将去盖后的培养皿移入玻璃罩室内培养或用相应规格的烧杯罩住培养,对于去掉盖的处理每天除上午8:00 观察是否需要补充相应质量浓度的博来霉素溶液外,其他时间应多次观察培养皿中的博来霉素溶液，若发现因蒸发导致溶液量减少及时用无菌水补足.

1.2.5 调查项目 调查各处理的始发芽时间、每天的发芽率、成苗率、苗情等指标,至0 mg/mL 质量浓度处理的麦苗长成2 叶期时止.

1.3 大田种植与后代变异情况统计

1.3.1 M0代的移栽方法 各博莱霉素质量浓度处理的培养皿苗为M0代（诱变零代）.诱变结束后,如果已到了冬小麦的播种季节（10 月10 日左右）,即可将M0代培养皿苗直接按处理移栽入试验田中,移栽后及时浇水保证成活;如果还未到冬小麦的播种季节,也可将M0代培养皿苗按博莱霉素质量浓度处理先移栽入营养钵中,放在阴凉处保存,到冬小麦播种季节后再移栽入试验田中.

1.3.2 M0代麦苗大田移栽成活率与生长情况调查 在M0代的整个生育期,除调查移栽成活率外还调查各博莱霉素质量浓度处理植株的生长异常情况,包括M0代麦苗植株生长异常类型、异常株率等.

1.3.3 M0代的收获与M1代的播种 第二年小麦成熟后,按不同的博莱霉素质量浓度处理收获并脱粒保存M0代种子;当年秋季冬小麦播种时,将各博莱霉素质量浓度处理的M0种子单穴单粒播种形成M1代群体,每处理播种不少于3 000 株.并以同样的方法播种对照种子.

1.3.4 M1代群体的变异情况统计 从M1代群体植株出苗到小麦成熟,整个生育期调查统计各博莱霉素质量浓度处理出现的变异性状类型、数量及变异率等.

2 结果与分析

2.1 各博莱霉素质量浓度处理培养皿种子的发芽生长情况

各博莱霉素质量浓度处理种子的发芽及生长情况见表1.

表1 各博莱霉素质量浓度处理种子的发芽及生长情况Tab.1 Germination and growth of seeds treated with Bleomycin in each concentrations

由表1 可以看出,随着博来霉素处理质量浓度的提高,“济麦22”种子的发芽时间推迟,发芽率降低.当博来霉素处理质量浓度为100 mg/mL 时“济麦22”种子不能萌发,仅有部分种子的种胚膨大胀破种皮,随后在种皮的破裂处形成类似愈伤组织的块状物.低质量浓度的博来霉素溶液对“济麦22”种子的发芽抑制作用较小,1 mg/mL 的博来霉素溶液仅使“济麦22”种子的发芽速度略微减慢,最终发芽率仍为100%,质量浓度为5 mg/mL、10 mg/mL 的博来霉素溶液使“济麦22”种子的发芽速度进一步减慢,最终发芽率为97.67%、95.33%,对发芽率的影响较小.高质量浓度的博来霉素溶液对萌发后的小麦幼苗的生长有较强的抑制作用, 10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 的博来霉素溶液处理的“济麦22”种子,在12 d 时同时达到了最大发芽率,但到15 d 时都未能长成二叶期幼苗,幼苗的平均株高仅为4.5 cm、3.1 cm、2.2 cm 都低于对照株高4.6 cm.较低质量浓度的博来霉素溶液对萌发后的小麦幼苗的生长有促进作用,1 mg/mL、5 mg/mL 的博来霉素溶液处理的“济麦22”种子虽然达到最高发芽率的时间较对照晚,但是15 d时的幼苗高度为5.3 cm、6.7 cm都高于对照,其中质量浓度为5 mg/mL 的博来霉素溶液对种子萌发后的幼苗促进生长作用最强.

2.2 博来霉素诱变处理M0 代麦苗的大田移栽成活及生长情况

各博来霉素质量浓度诱变处理M0代麦苗移栽成活率及生长异常株率见表2.

表2 各博来霉素溶液质量浓度诱变处理M0 代麦苗移栽成活率及生长异常株率Tab.2 The survival rate and abnormal growth rate of M0 generation wheat seedlings treated by various Bleomycin concentrations

由表2 可以看出,高质量浓度的博来霉素溶液诱变小麦种子,对M0代麦苗都有一定生理损伤,具体表现为:部分小麦植株生长畸形,叶片扭曲,抽穗畸形等;部分小麦植株生长停止,不能拔节,不能抽穗,形成小老苗;部分小麦植株出现花叶;还有部分M0代苗出现白化、黄化而死亡.本试验用质量浓度为1 mg/mL、5 mg/mL 的博来霉素质量溶液处理的M0代苗中未发现因生理损伤而造成的植株生长异常;用质量浓度为10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 的博来霉素溶液处理的M0代苗中都不同程度的出现了因生理损伤而造成的生长异常植株.随着博来霉素溶液质量浓度的提高M0代植株的生理损伤加重,生长异常植株率也提高,极端异常植株（小老苗、白化株、黄化株）也出现.

博来霉素诱变处理的M0代植株都是由正常的原母体细胞和发生各种基因突变细胞形成的嵌合体.当博来霉素质量浓度较低时发生基因突变细胞占比低,植株的生长表现由占绝大多数正常的原母体细胞决定,所以未明显表现出生长异常;当博来霉素质量浓度较高时发生各种基因突变的细胞占比高,且随着博来霉素质量浓度的提高发生基因突变细胞占比也提高,因此M0代植株在生长过程中出现生长异常的几率增加.

2.3 博来霉素诱变处理M1 代变异类型及变异率的统计

各博来霉素诱变各处理M1代变异类型及变异率的统计表见表3.

由表3 可以看出,不同质量浓度的博来霉素溶液诱变处理“济麦22”种子,在M1 代中均能产生可遗传的变异,随着博来霉素质量浓度的提高性状变异类型越丰富,变异频率也越高.本试验采用25 mg/mL博来霉素质量浓度诱变处理的“济麦22”种子接近半致死剂量,M1代群体中性状变异类型丰富,有益变异频率较高,因此,在采用“小麦种子在博来霉素溶液中萌发生长”的诱变方法进行诱变时,宜采用的博来霉素溶液质量浓度为25 mg/mL.

表3 各博来霉素诱变各处理M1 代变异类型及变异率的统计表Tab.3 Statistical table of variation type and variation rate of M1generation treated with Bleomycin concentration mutation

3 结论与讨论

本研究证实了博来霉素对小麦具有诱变效应,能够诱导小麦产生可遗传的变异.M1代群体田间变异类型及变异率调查数据表明,博来霉素质量浓度的提高,M1代性状变异类型丰富,变异频率也越高.这是因为在M0代小麦胚细胞的分裂DNA 复制合成过程中,博来霉素与铁的复合物嵌入小麦胚细胞DNA,引起DNA 单链和双链断裂，在小麦细胞DNA 自我修复的过程中发生基因突变造成的.

本试验采用的“小麦种子在博来霉素溶液中萌发生长”的诱变方法切实可行.与文献[7-15]平阳霉素诱变小麦的各种方法相比,本诱变方法对M0代细胞诱变时间长,M0代细胞被诱变的代数多,在M0代这种由基因突变细胞和正常细胞构成的嵌合体中基因突变细胞所占的比例较大,基因突变细胞形成生殖细胞将突变基因遗传给M1代个体的几率也大.

采用“小麦种子在博来霉素溶液中萌发生长”的诱变方法进行诱变时,宜采用博来霉素溶液质量浓度为25 mg/mL.此时“济麦22”种子的成苗率为53.33%,接近化学诱变的半致死剂量.小麦种子和幼苗对博来霉素的耐受力强,本试验“济麦22”种子能够在50 mg/mL 质量浓度的博来霉素溶液中萌发,幼苗还能够在50 mg/mL 质量浓度的博来霉素溶液中长时间生长;总结现有文献[7-15],在应用平阳霉素诱变小麦时一般使用的质量浓度都在微克每毫升级别，诱变时间也只有短短几个小时，说明平阳霉素对小麦的生理损伤较大,分析其原因可能是平阳霉素中所含有的博来霉素以外的抗生素成分对小麦的生理损伤大,致使不能使用高剂量的平阳霉素对小麦进行化学诱变.

博来霉素和平阳霉素是类似药物[2-3],二者都应用于临床,通过干扰抑制肿瘤细胞DNA 合成来阻止癌细胞的增殖,它们这种干扰抑制细胞DNA 合成的特性还能应用于植物的化学诱变.利用博莱霉素进行化学诱变创制小麦新种质资源和新品种培育是一条高效途径,博来霉素诱变和常规育种技术相结合可以拓宽基因变异范围,加速育种进程,提高育种效率.