冬小麦品种(系)品质相关基因的分子标记检测

昝香存，常莹莹，韩留鹏，高 崇，赵明忠，董海滨，齐学礼，王永霞，胡 琳

(河南省农业科学院作物分子育种研究院/河南省小麦生物学重点实验室/河南省麦类种质资源创新与改良重点实验室，河南郑州 450002)

面条是中国传统主食之一，其品质主要受冬小麦蛋白质含量、面筋强度、面粉色泽、多酚氧化酶(PPO)活性、淀粉特性以及1BL·1RS易位的影响。其中，小麦的面筋强度主要受高分子量谷蛋白亚基、1B/1R易位等因素的影响。位点上的5+10亚基以及位点上的7+8亚基对面筋强度影响较大，利用Dx5和By8标记可准确快速地检测小麦品种中是否含有5+l0和7+8优质亚基。1BL·1RS易位在中国小麦育种中广泛应用，但1BL·1RS易位易导致面筋强度减弱，对面条加工品质的负面效应明显，利用H2O分子标记可快速、准确地检测1BL·1RS易位的存在。

黄色素含量和PPO活性是影响面制品色泽及其稳定性的主要因素。其中，黄色素含量受多个基因位点的调控，其中位于第七部分同源群上的QTL效应最大。He等开发了黄色素含量基因标记YP7A和YP7B，利用前者可有效区分小麦7A染色体上基因的等位变异(与高黄色素含量相关)和(与低黄色素含量相关)，利用后者可有效区分小麦7B染色体上位点的等位变异(与中等黄色素含量相关)和(与低黄色素含量相关)、(与高黄色素含量相关)。芦 静等研究发现，用YP7A标记检测出的等位变异和与黄色素含量显著相关，而用YP7B标记检测出的等位变异和与黄色素含量没有表现出显著相关，因而，YP7A标记可作为黄色素含量的辅助选择标记。PPO活性是引起面制品颜色褐变的主要因素，其受环境和基因型的共同影响，但基因型是其主要的影响因素。控制PPO活性的主效基因位于2AL和2DL染色体上，位于2AL染色体上基因的效应明显大于位于2DL染色体上的基因。利用Sun等开发的共显性STS标记PPO18可有效区分2AL染色体上基因的等位变异和。

分子标记辅助选择是品质遗传改良的有效途径。胡凤灵等利用、、、、 1BL·1RS、和基因的特异性分子标记对221份中国冬小麦品种(系)进行检测，明确了高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)、低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)相关基因的等位变异以及1BL·1RS易位的分布频率。胡凤灵等和杨芳萍等利用分子标记YP7A分别检测了基因的等位变异在冬小麦品种(系)中的分布频率。肖永贵等利用基因的功能标记PPO18、PPO29和PPO16检测311份中国冬小麦品种，发现中国冬麦区低PPO活性基因和的分布频率相对较高，分别为58.2%和59.8%。定期利用分子标记检测育成品种(系)中品质相关基因的分布情况，可为品质育种研究和亲本选配提供有价值的信息，加快小麦品质改良的步伐。本研究利用Dx5、By8、YP7A、PPO18和H2O特异性分子标记，对2010年以来中国冬小麦主产省份育成的266份小麦品种(系)进行检测，了解10年来育成小麦品种(系)的面筋强度、PPO活性、黄色素含量及1BL·1RS易位相关基因的分布情况，以期为优质面条小麦新品种选育和选配具有优质基因或聚合一定优质基因的亲本提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料共266份，其中河南166份、安徽15份、江苏16份、陕西14份、山东23份、河北20份，北京12份(表1)，于2019年秋种植在河南省农科院试验基地。供试材料大部分为2010年以后审定的品种(系)，少部分为正在参加各类区域试验的新品系及自主选育的高代品系。

表1 266份冬小麦品种(系)品质相关基因的分子标记检测结果Table 1 Identification of quality-related genes in 266 winter wheat cultivars(lines) using molecular markers

(续表2 Continued table 2)

(续表2 Continued table 2)

1.2 基因组DNA的提取

于小麦越冬期进行田间叶片取样。用CTAB法提取植株叶片的基因组DNA。用NanoDrop紫外分光光度计检测DNA的浓度，稀释为40～60 ng·μL后，4 ℃保存备用。

1.3 分子标记的检测

Dx5、By8、H2O、YP7A和PPO18标记的引物序列及其他相关信息见表2。PCR反应体系均为10 μL，包括上、下游引物(20 mmol·L)各0.2 μL，PCR Mix 5 μL，DNA模板(50 ng·μL)1 μL，用ddHO补足至10 μL。Dx5、By8、H2O、PPO18和YP7A标记的PCR扩增程序参考相应的文献。所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像系统拍照分析。

表2 检测目标基因等位变异所用的标记及其引物信息Table 1 Markers and primers information for detecting alleles of the target genes

2 结果与分析

2.1 Dx5基因的分子标记检测结果

用标记Dx5对供试材料的基因进行检测，部分材料的检测结果如图1A所示。266份材料中，有85份可扩增出450 bp的特异性片段，说明这85份材料中含有基因，分布频率为 32.0%(表1和表3)。基因在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率存在较大差异，分布频率从高到低依次为山东(60.9%)>河北 (45.0%)>江苏(37.5%)>陕西(28.6%)>河南 (27.7%)>北京(25.0%)>安徽(20.0%)(表3)。

2.2 By8基因的分子标记检测结果

用标记By8对供试材料的基因进行检测，部分材料的检测结果如图1B所示。266份材料中，有77份材料可以扩增出527 bp的特异性片段，说明这77份材料含有基因，分布频率为28.9%。基因在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率从高到低依次为山东(65.2%)>河北 (45.0%)>江苏(31.3%)>北京 (25.0%)>陕西 (21.4%)>河南(24.1%)>安徽(13.3%)(表3)。

2.3 1BL·1RS易位的分子标记检测结果

用标记H2O对供试材料的1BL·1RS易位进行检测，部分材料的检测结果如图1C所示。266份材料中，有122份材料可扩增出1 598 bp的特征条带，说明这122份材料含有1BL·1RS易位，分布频率为45.9%，而其他144份材料不含1BL·1RS易位。1BL·1RS易位在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率不同，分布频率从高到低依次为江苏(81.3%)>河南(57.2%)>陕西(35.7%)>安徽(20.0%)>河北(15.0%)>山东(8.7%)>北京(8.3%)(表3)。

2.4 Ppo-A1基因的分子标记检测结果

用共显性标记PPO18对供试材料的基因进行检测，部分材料的检测结果如图1D所示。266份材料中，有144份材料可扩增出685 bp的特征条带，说明这144份材料含有高PPO活性等位基因，分布频率为54.1%；有122份材料可扩增出876 bp的特征条带，说明这122份材料含有低PPO活性等位基因，分布频率为45.9%。和等位基因在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率存在较大差异，其中，的分布频率从高到低依次为山东(95.7%)>北京(83.3%)>河北(75.0%)>陕西(42.9%)>江苏 (37.5%)>安徽(40.0)>河南(34.3%)，在不同小麦主产省份的分布频率高低排序则相反(表3)。

A：标记Dx5的PCR扩增结果；B：标记By8的PCR扩增结果；C：标记H2O的PCR扩增结果；D：标记PPO18的PCR扩增结果。M：DL2000；1：徐麦15158；2：囤麦259；3：郑麦1833；4：新麦45；5：西农529；6：洛麦40；7：伟隆169；8：郑麦0943；9：郑麦379；10：华麦2801；11：丰德存麦21；12：石优4399；13：济麦38。图2同。

2.5 Psy-A1基因的分子标记检测结果

用共显性标记YP7A对供试材料的基因进行检测，部分材料的检测结果如图2所示。266份材料中，有203份材料可扩增出194 bp的特征条带，说明这203份材料含有高黄色素含量等位基因，分布频率为76.3%；有63份材料可扩增出231 bp的特征条带，说明这63份材料含有低黄色素含量等位基因，分布频率为23.7%。和等位基因在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率存在较大差异， 其中，的分布频率从高到低依次为山东(100.0%)>北京(83.3%)>河北 (80.0%)>河南(77.1%)>安徽(66.7)>江苏 (56.3%)>陕西(50.0%)，在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率高低排序则相反(表3)。

表3 品质相关基因等位变异和1B/1R易位在不同小麦主产省份的分布频率Table 3 Distribution frequencies of alleles and 1B/1R translocation of quality-related genes in major wheat producing provinces

图2 标记YP7A对部分小麦品种(系)的PCR检测结果

2.6 聚合优质等位基因材料的分布

由表4可知，在266份材料中，聚合多种优质基因的品种(系)较少，其中携带///基因组合且不含1BL·1RS易位的材料仅有2份，分布频率为0.8%，分别为藁优5766和郑石9170；携带///基因组合且不含1BL·1RS易位的材料有23份，分布频率为8.7%。其中，来自河南的有8份，来自山东的有8份，来自河北和北京的分别有6份；携带//基因组合但含1BL·1RS易位的材料有12份，分布频率为4.5%。

表4 聚合品质性状优异等位基因的小麦品种(系)Table 4 Cultivars(lines) with excellent gene combinations for quality traits

3 讨 论

3.1 Dx5、 By8基因和1BL·1RS易位在品质育种中的应用

面筋强度是影响面条品质的主要因素之一。和对面筋强度的贡献比较大。本研究检测的266份小麦品种(系)中，和的分布频率分别为32.3%和28.9%，与胡凤灵等的研究结果相比，的分布频率稍有上升，的分布频率略有下降。和在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率差异均较大，在山东、河北品种(系)中的分布频率相对较高，分别为60.9%和65.2%、45.0%和45.0%，说明近10年来山东和河北在小麦品质育种中注重优质亚基基因和的应用和 选择。

1BL·1RS易位对面筋强度有负面影响，但1BL·1RS易位系在抗病、丰产、耐旱以及花后叶片保持绿色等方面具有明显的优势，备受育种家的青睐。因此，1BL·1RS易位在中国乃至世界范围内被广泛利用。本研究检测的266份小麦品种(系)中，含有1BL·1RS易位的品种(系)占供试材料的 45.9%，与前人的研究结果相比，呈增加趋势，说明近10年来 1BL·1RS易位系在中国小麦育种中仍被广泛应用。本研究结果表明， 1BL·1RS易位品种(系)在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率存在较大差异，其中江苏和河南的材料中1BL·1RS易位的分布频率较高，而在河北、山东和北京的材料中分布频率较低，这可能与本研究收集的材料有关，也可能与育种家选用的亲本材料或在选育过程中注重的选择目标有关。对于河南来说，1BL·1RS易位出现的频率较高，其主要原因可能是河南为中国粮食生产核心区，是国家的粮仓，承担着保障国家粮食安全的重担，在产量压力选择下，1BL·1RS易位系作为育种亲本应用较多，并在后代选择中注重抗病性、丰产性和抗逆性的综合考虑，所以在河南选育的小麦品种(系)中，1BL·1RS易位系出现的频率较高。

在未来小麦品质改良方面，选育强筋小麦品种时一方面可选用不含1BL·1RS易位的亲本材料，另一方面应从改良1BL·1RS易位系的品质入手。本研究筛选出12份聚合//基因的易位系材料，这为1BL·1RS易位系的品质改良提供了研究材料。

3.2 YP7A、PPO18标记在品质育种中的应用

面制品色泽是面条小麦育种的主要目标之一。用基因特异性标记能快速鉴定品质性状的基因型，为育种提供简单易行的鉴定方法。本研究利用YP7A标记检测基因在266份冬小麦品种(系)中的等位变异，结果表明，含有和的品种(系)分别占供试材料的75.9%和24.1%，这与杨芳萍等的研究结果一致，均为的分布频率远高于。和在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率差异较大，其中和在陕西品种(系)中的分布频率均为50.0%，这与张影全等的研究结果一致；在北京品种(系)中的分布频率为83.3%，与杨芳萍等的研究结果(75.0%)相比，呈增长趋势；此外，在山东和河北品种(系)中的分布频率也很高，尤其是山东23份材料中全部含有。原因可能与育种家选用的亲本材料基因型有关，也可能与人们对营养品质的需求增加，导致育种家对的定向选择有关。

小麦籽粒PPO催化褐变反应，导致面条感官品质和营养价值下降，选育低PPO活性小麦品种(系)也是面条小麦品质改良的重要目标之一。本研究用PPO18标记对供试材料进行检测，发现266份材料中含有的品种(系)占全部供试材料的45.5%，这与王黎明等的结果 (48.5%)基本一致，而与肖永贵等(58.2%)和胡凤灵等(53.8%)的研究结果相比，的分布频率有所降低。出现这种差异的原因可能在于供试材料的来源及构成不同。本研究还发现，和在不同小麦主产省份品种(系)中的分布频率存在明显差异，与低PPO活性相关的在山东、北京和河北品种(系)的分布频率较高，而河南和江苏品种(系)的分布频率较低，这与育种家所选用的亲本材料有关，以及长期选择过程中对小麦品种PPO活性选择的重视程度不同，导致不同省份之间存在较大的差异，因此，河南和江苏小麦育种工作者应加大低PPO活性小麦品种(系)选择的力度。

4 结 论

明确了近10年来小麦主要生产省份新育成品种(系)中、、、基因和1BL·1RS易位的分布情况，并分别筛选到2和23份含有///和///基因组合且均不含 1BL·1RS易位的材料，可作为优质面条小麦育种的亲本材料；筛选到12份含有//基因组合且含有1BL·1RS易位的材料，可作为1BL·1RS易位系品质改良的研究 材料。