三种简易方法提取福建牡蛎多糖的效果对比

曾 臻，周碧盈，丰 艳，陆馨敏，杨彩娟，卢艺玲，罗家英，谭强来，吴兰兰*

（1.厦门医学院 海洋生物医药资源福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361023；2.厦门医学院 天然化妆品福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361023）

牡蛎味美肉细、药食同源，在《神农本草经》《本草纲目》等中医药典籍中早有记载。由于牡蛎兼具鲜美的食用价值和较高的药用价值，因此牡蛎也名列原卫生部公布的第一批《既是食品又是药品的物品名单》。随着现代先进科学理念及高新加工技术的引入，牡蛎功效成分及其生理活性研究越来越受到关注。研究表明，牡蛎中含有丰富的多糖、多肽、牛磺酸等活性成分，呈现出抗疲劳、抗氧化、增强免疫力等多种生理功能[1]。其中，牡蛎多糖的开发利用已经成为目前药品、保健食品等相关产业的热门方向之一。如ZHONG 等[2]研究表明低分子量牡蛎多糖可缓解肿瘤细胞介导的对骨髓源性树突状细胞功能的高干度抑制，具有体内抗肿瘤活性。CAI 等[3]研究了牡蛎多糖对5-氟尿嘧啶治疗的S180荷瘤小鼠的肠道黏膜炎及代谢的改善作用。

牡蛎种群较多，在我国分布广泛，如福建牡蛎（Crassostrea angulata）、太平洋牡蛎（C.gigas）、香港牡蛎（C.hongkongensis）、近江牡蛎（C.ariakensis）、熊本牡蛎（C.sikmea）、日本牡蛎（C.nippona）等。福建牡蛎的产量最高，是福建、浙江、广东东部等地区的主要养殖品种。据统计，2018 年福建牡蛎的产量2.12×106t，其中福建省产1.89×106t，分别占比全国牡蛎总产量41.20%和36.85%[4-5]。不同种群的牡蛎的多糖含量及结构或存在一定差异。研究表明，太平洋牡蛎多糖分子量为1 299 kDa，是以葡萄糖1 种单糖组成的D-吡喃型葡聚糖[6]。杨大俏等[7]分离纯化得到3 种近江牡蛎多糖，其单糖组成及分子量大小均不一致，分别为9 种单糖组成的1.24×105Da、6 种单糖组成的6.7×104Da、3 种单糖组成的8.3×103Da。然而，福建牡蛎的多糖含量及结构等研究并未见详细报道。

如要有效开发利用牡蛎多糖，其大量提取制备是首先要解决的第一步。牡蛎多糖提取方法多样，如水提醇沉法[8]、酶解提取法[9]、热碱提取法[10]等。利用不同的方法、不同的介质、不同的参数进行牡蛎多糖提取，其提取效率并不相同[11]。如侯丽等[8]通过水提醇沉法获得牡蛎多糖粗品，以干基计的提取率为15.39%，纯度为81.23%。杨大俏等[9]采用酶解提取法近江牡蛎粗多糖，以干基计的提取率为21.29%，纯度为85.18%。因此，本研究依托大学生创新创业训练计划项目，采用三种简易方法分别提取福建牡蛎的粗多糖，进而测定含量以对比及分析效果，以期了解较适合采用的福建牡蛎多糖的提取制备方法，为有效开发利用福建牡蛎多糖提供数据参考，也为福建牡蛎精深加工产业发展给予一定助力。

1 试验部分

1.1 试剂

福建牡蛎（福建省厦门市集美区灌口镇菜市场，个体重量在3.8～14.0 g 之间，经流水洗净后，开壳收集牡蛎全组织备用）；葡萄糖、氢氧化钾、无水乙醇、冰乙酸等常规试剂（国药集团化学试剂有限公司）；碱性蛋白酶、胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器

UV-5200 紫外可见分光光度计（元析，上海）；DK-S26电热恒温水浴锅（精宏，上海）；DHG-9023A 恒温鼓风干燥箱（一恒，上海）；PHS-3C 型pH 计（仪电，上海）；HiPette 手动移液器（大龙，北京）；T25 高速分散机（I KA，德国）；myPlate 磁力搅拌器（IKA，德国）；Vortex 3 漩涡混匀器（IKA，德国）；3K15 低温高速离心机（Sigma，德国）；KA92NV02TI 冰箱（Siemens，德国）；Quintix5102 电子天平（Sartorius，德国）。

1.3 福建牡蛎多糖的提取方法

1.3.1 水提醇沉法

参考并适当修改侯丽等[8]的水提醇沉法对福建牡蛎多糖进行简易提取。方法简述如下：准确称取100 g福建牡蛎全组织，加入300 g 去离子水，利用高速分散机充分匀浆备用；从中准确称取200 g，加入200 mL 95%乙醇，室温磁力搅拌2 h，6×103r/min 离心15 min收集沉淀，再加入200 g 去离子水，于90℃恒温水浴中浸提2 h，流水冷却后同上离心收集上清，重复浸滤后合并，调节pH 值至4.6，同上离心收集上清，加入无水乙醇至终浓度为70%，同上离心收集沉淀后干燥，获得牡蛎多糖粗提物，称重并测算粗得率。

1.3.2 酶解提取法

参考并适当修改杨大俏等[7，9]的酶解提取法对福建牡蛎多糖进行简易提取。方法简述如下：准确称取100 g 福建牡蛎全组织，利用高速分散机匀浆10 min，加入150 g 去离子水，再次混匀后置于55℃恒温水浴0.5 h，调节pH 值至8.0，添加0.8%的复合酶（碱性蛋白酶：胰蛋白酶=3∶1），继续恒温水浴酶解2 h，随后煮沸灭酶，1×104r/min 离心10 min 收集上清，调节pH值至7.0，采用0.22 μm 滤膜过滤除杂后干燥，获得牡蛎多糖粗提物，称重并测算粗得率。

1.3.3 热碱提取法

参考并适当修改陈骞等[10]的酶解提取法对福建牡蛎多糖进行简易提取。方法简述如下：准确称取100 g福建牡蛎全组织，加入100 g 去离子水，利用高速分散机充分匀浆，加入100 mL 30%的氢氧化钾溶液，沸热1 h，冷却后加入150 mL 95%乙醇，过滤收集沉淀，再次溶解至100 g 去离子水，利用冰乙酸调节pH 值至7.0，再次过滤收集上清，加入等体积的95%乙醇后干燥，获得牡蛎多糖粗提物，称重并测算粗得率。

1.4 福建牡蛎多糖的含量测定方法

选用苯酚-硫酸法。方法简述如下：配制100 μg/mL的葡萄糖标准使用溶液，分别精密吸取0、80、160、240、320 μL 于10 mL 塑料离心管中，用去离子水分别补足至400 μL 后，每管各加入6%苯酚溶液200 μL，轻晃摇匀，再快速垂直加入浓硫酸1 mL，涡旋混匀，反应20 min 后冷却至室温，测定490 nm 波长处吸光度，利用EXCEL 绘制标准曲线（横坐标：葡萄糖质量，纵坐标：吸光度），获得拟合曲线及其方程。上述三种方法提取制备的福建牡蛎多糖样品经适当稀释一定倍数后，同样方法准确移取400 μL，按上述步骤，测定吸光度值，根据标准曲线换算出相应含量，并计算福建牡蛎多糖的纯度。

1.5 数据处理方法

如无特别标注，实验平行测定三次，采用WPS Office 2019 Excel 及GraphPad Prism version 5.01 进行数据分析及图形绘制，数据表示为均值±标准偏差（m±SD）。

2 结果与分析

2.1 三种方法提取制备福建牡蛎多糖的粗得率对比

三种方法提取制备福建牡蛎多糖的粗得率对比如图1 所示。由图1 可知，以湿重计，水提醇沉法提取制备福建牡蛎多糖的粗得率（%）为1.25±0.21，酶解提取法的得率（%）为0.68±0.09，热碱提取法的粗得率（%）为0.98±0.18。表明采用水提醇沉法提取制备的粗得率较高。在此基础上，进一步采用苯酚-硫酸法测定其中福建牡蛎多糖的含量。

图1 三种方法测定福建牡蛎多糖含量的粗得率对比图

2.2 苯酚-硫酸法的标准曲线的线性拟合分析

苯酚-硫酸法的标准曲线如图2 所示，通过对数据进行线性回归，得到含量C-吸光度A 的拟合方程：y=0.0099x+0.1012，相关系数R2为0.9998。表明该标准曲线的线性拟合度合格，可用于后续福建牡蛎多糖的含量测定。

图2 苯酚-硫酸法的标准曲线图

2.3 三种方法提取制备福建牡蛎多糖的纯度对比

三种方法提取制备福建牡蛎多糖的纯度对比如图3 所示。由图3 可知，水提醇沉法提取制备福建牡蛎多糖的纯度（%）为33.68±5.76，酶解提取法的纯度（%）为64.73±4.47，热碱提取法的纯度（%）为33.09±2.55。表明采用酶解提取法提取制备福建牡蛎多糖的纯度较高。

图3 三种方法测定福建牡蛎多糖含量的纯度对比图

3 结束语

福建省是我国最大的牡蛎养殖省份，据测算，2017年福建省牡蛎产量178.81 万t，占全国牡蛎总产量37%，产值56 亿元人民币[12]。虽然福建省牡蛎养殖规模大、产量高，但绝大多数用作鲜食和冷冻、干制等传统加工产品，产品附加值较低，急需融入现代食品加工高新技术进行精深加工和高附加值化利用。然而，相比其他牡蛎种群，福建牡蛎研究主要集中在品种选育及相关基因功能等方面，如对福建牡蛎3β-HSD[13]、SMRP1[14]、17β-HSD[15]等基因克隆及表达，以及对福建牡蛎选育群体的遗传多样性[16]、数量性状[17]、营养成分差异[18]等，而对多糖等食药相关成分的分析较为薄弱。

本研究对比三种简易常用方法提取制备福建牡蛎粗多糖的效果，研究结果表明采用水提醇沉法提取制备的得率较高，且操作较为简便（图1）。高蒙蒙等[6]依次采用室温水提、60℃水提和稀碱提取太平洋牡蛎多糖，发现常温水提得法的率最高。胡玲玲等[19]发现采用水提醇沉法提取枸杞多糖步骤简单、得率较高。王静等[20]也发现水提醇沉法工艺方便可靠、简单经济，适用于山慈菇多糖的提取。此外，研究结果表明采用酶解提取法提取制备福建牡蛎多糖的纯度较高（图3）。任壮[21]探究了利用酶解的方式以优化提取海带多糖。张瑞娟等[22]对比测试了6 种蛋白酶对皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）内脏进行酶解提取多糖的效果，发现碱性蛋白酶的效果最好。因此，本研究结果可为有效开发利用福建牡蛎多糖提供数据参考，也为福建牡蛎精深加工产业发展给予一定助力。