槟榔加工副产物代料栽培对平菇子实体及物质转化的影响

包怡红，贾雨彤，赖章飞，潘飞兵，匡凤姣

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；3.海南华创槟榔研究院，海南海口 570100；4.海南口味王科技发展有限公司，海南万宁 571501）

平菇是侧耳属（Pleurotus）中普遍栽培的糙皮侧耳、凤尾菇、白黄侧耳等食用菌的统称[1]。平菇肉质肥厚、味道鲜美、营养丰富，是世界上栽培量较大的食用菌之一，也是我国发展速度较快、栽培面积较广、经济效益较高的食用菌。平菇具有耐低温、出菇快、产量高等特点，应用的栽培原料较为广泛，如玉米秸秆、棉籽壳等农副产品的下脚料均可[2]。随着食用菌产业快速发展，阔叶树木屑资源被大量消耗，菌林矛盾日益突出，栽培料的数量和种类成为制约行业发展的首要问题[3]。

因此，积极寻找代用料栽培食用菌至关重要。目前，关于代料栽培食用菌国内外已有很多报道，Ropciuc 等[4]以咖啡渣为替代料，成功栽培出了活性成分含量较高的平菇。Mandeel 等[5]以废弃纸板为替代料栽培出的平菇生物学效率较高。徐建俊等[6]研究发现，以桑枝屑代料栽培的香菇含有丰富的矿物质，粗蛋白、粗脂肪和粗纤维，具有较高营养价值和药用保健性。贾静等[7]研究发现，以菌糠代替木屑制成培养料栽培元蘑，元蘑可正常生长，当替代料含量为30%时，生长效果最好，证明了以菌糠为替代料栽培元蘑的可行性。

槟榔（Areca catechuL.）是单子叶植物纲、棕榈科，是海南省的主要经济作物之一[8]。槟榔是四大南药之首，蕴含丰富的天然活性物质[9]。槟榔果加工中会产生槟榔核、槟榔蒂等大量的副产物，其中含有多酚、黄酮、纤维素等丰富的营养物质[10]，但是现在多数企业采取直接废弃的方式，这不仅造成了资源浪费，不能充分实现槟榔的经济与营养价值，还会对环境造成污染。而食用菌具有强大的富集作用，利用槟榔加工副产物作为食用菌的栽培基质，可以富集槟榔副产物中的营养成分。近年来，对槟榔副产物的利用主要集中在多酚及槟榔碱的提取分离纯化研究[11−13]，利用槟榔加工副产物作为食用菌的栽培基质研究还存在不足。

本文利用槟榔加工副产物槟榔核和槟榔蒂分别作为食用菌栽培料，进行可行性研究和主要成分的物质转化分析，实现槟榔加工副产物变废为宝，对于槟榔生产加工业以及环境保护都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原材料槟榔核、槟榔蒂 由海南华创槟榔研究中心提供；供试平菇菌种平菇一号 由黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏室提供；玉米芯、聚丙烯塑料袋（16.50 cm×35.00 cm） 购于哈尔滨农副产品批发市场；没食子酸和芦丁标准品 上海源叶生物科技公司；无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、碳酸钠、硝酸铝、硫酸铜、硫酸钾、高氯酸、葡萄糖，琼脂粉、碳酸钙和香草醛等 均为分析纯，天津市天力化学试剂有限公司。

DY04-13-44-00 立式压力蒸汽灭菌器筒 上海东亚压力容器制造有限公司；DH6000A 型电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；722 型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；pHS-3E 型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 平菇菌种活化 取平菇菌块（d=4 mm）接种于PDA 平板中央，然后将其置于27 ℃恒温箱内避光培养，空气湿度为70%，待菌丝长满平板后作为试管阶段母种。母种经PDA 试管培养基复壮后，再扩繁至50 mL 组培瓶中，置于27 ℃恒温箱内避光培养，空气湿度为70%，培养为原种。然后再用玉米芯培养基在栽培袋里27 ℃恒温培养扩大为栽培种。栽培种培养基组分为：玉米芯88%、麦麸10%、石灰1%、碳酸钙1%。

1.2.2 培养料试管培养条件优化

1.2.2.1 试管培养 以槟榔副产物槟榔核和槟榔蒂分别作为替代料，玉米芯为常规培养料。按照粒径大小、含水量、替代料含量设计进行平菇培养料一级筛选。一级配方筛选用试管规格8.0 cm×1.8 cm，每组5 个重复，121 ℃高压灭菌2 h，冷却至28 ℃以下，按无菌操作规程接种，在PDA 平板中取菌块（d=4 mm）接种于试管基质起始点。置于27 ℃恒温培养箱避光培养，空气湿度为70%。每隔3 d 在试管外用马克笔进行前端划线，测定菌丝生长速度和菌丝体长势。

菌丝长势：指菌丝生长的强弱，包括菌丝体洁白程度和浓密程度。观察记录菌丝长势，用“+、++、+++、++++、+++++”分别表示菌丝长势较差、一般、良好、较好、好。优质菌种菌丝应色泽纯正、菌丝粗壮、分枝多而密[14]。

菌丝生长速度（cm/d）=菌丝生长长度（cm）/菌丝生长天数（d）[15]。

1.2.2.2 培养料含水量的选择 以副产物45%、玉米芯43%、麦麸10%、石灰1%、碳酸钙1%为培养料配方，改变水分含量，接种至含水量为55%，60%，65%，70%，75%的培养料中，接种量为10%，培养料粒径大小为0.15～0.3 cm，调节pH 为7.0 左右，进行水分含量的筛选，并以菌丝体生长速率、生长势为测定指标，确定最适水分含量。

1.2.2.3 培养料粒径大小的选择 在最适水分含量条件下，以副产物45%、玉米芯43%、麦麸10%、石灰1%、碳酸钙1%为培养料配方，将培养料用不同规格的土壤分样筛筛分为<0.05 cm，0.05～0.15 cm，0.15～0.3 cm，0.3～0.45 cm 和>0.45 cm，5 种粒径等级，接种量为10%，调节pH 为7.0 左右进行筛选。以菌丝体生长速率、生长势为测定指标，确定最适粒径大小。

1.2.2.4 培养料中替代料含量的选择 在最适粒径大小和最适水分含量条件下，以副产物0%、15%、30%、45%、60%、75%的替代量进行接种，接种量为10%，调节pH 为7.0 左右，进行筛选。以菌丝体生长速率、生长势为测定指标，确定最适替代料含量。

1.2.3 平菇栽培试验 根据初步试管筛选试验的结果，筛选出4 个适宜平菇生长的配方进行菌袋栽培试验（不添加副产物为对照组）常用配方：槟榔加工副产物30%～50%、玉米芯78%～38%、麦麸10%、生石灰1%、碳酸钙1%。

将所有培养料混合后搅拌均匀，每袋装料量约800 g，每组5 个重复，121 ℃高压灭菌2 h，冷却至28 ℃以下，按无菌操作规程接种，接种量为6%，接种于袋料基质起始点。接种后置于发菌室内避光培养，培养温度为28 ℃，空气湿度为70%；菌丝长满，菌袋开口后保持湿度为80%，子实体8 成熟时采收（判断标准为菌褶全部伸展，菌盖充分展开[16]。测定生物学效率及子实体中营养成分。

生物学效率（%）=鲜菇质量（g）/干料质量（g）×100[15]。

1.2.4 混合培养料及子实体营养成分的测定

1.2.4.1 样品处理 取培养料和平菇子实体干燥箱烘干、粉碎、过40 目筛，保存备用。

1.2.4.2 蛋白质含量 按照国标GB 5009.5—2016中的方法测定[17]。

1.2.4.3 多糖含量 据文献[18]稍作修改，精密称取样品10.0 g 置于圆底烧瓶中，加入100 mL 95%乙醇，80 ℃回流2 h，滤渣加入100 mL 蒸馏水，回流提取2 h，抽滤，重复2 次，合并滤液浓缩至一定体积，加无水乙醇至含醇量为80%，放置24 h，抽滤，沉淀依次用乙醇、丙酮、乙醚各10 mL 洗涤，50 ℃烘干，称重，得粗多糖样品。称取待测样品5.0 mg 加蒸馏水定容至50 mL，冷藏备用。准确吸取待测液2 mL于具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入浓硫酸7 mL，摇匀，40 ℃水浴30 min 后冷却至室温，于486 nm 波长处测定吸光度。以葡萄糖为标准品，按上述方法绘制标准曲线为y=7.4193x−0.1757，R2=0.9997，根据标准曲线计算多糖含量。

1.2.4.4 还原糖含量 用DNS 法测定[19]。称取15 g样品，加入300 mL 蒸馏水，100 ℃沸水中回流提取3 h，放冷，纱布过滤。滤渣再次加入300 mL 水，沸水回流提取3 h，同样方法重复提取两次。合并滤液，定容至100 mL，为待测液。吸取2 mL 待测液，再加入1.5 mL DNS 试剂，塞好试管，沸水浴7 min，以空白为参比，540 nm 波长条件下测定吸光值。以葡萄糖为标准品测定标准曲线为y=0.2571x−0.0081，R2=0.9997。根据标准曲线测定计算还原糖含量。根据实验测得的还原糖含量乘上系数0.9 得半纤维素含量。

1.2.4.5 总酚含量 参考文献[20]稍作修改，准确称取样品粉末10 g，加入100 mL 70%乙醇，55 ℃超声辅助提取45 min，重复提取3 次，合并滤液，真空浓缩得粗多酚样品。准确吸取1 mL 待测液，加入5 mL 10%的福林酚，摇匀，静置8 min 后加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀，于常温下暗反应2 h，在765 nm 波长处测定吸光度，以没食子酸为标准品绘制标准曲线为y=0.0124x−0.0176，R2=0.9999。根据标准曲线计算总酚含量。

1.2.4.6 黄酮含量 参考文献[21]稍作修改，称取样品粉末2 g，加入90 mL 55%乙醇，50 ℃超声波辅助提取30 min，重复提取3 次，合并滤液，真空浓缩得粗样品。准确吸取1 mL 待测液，加入13 mL 30%乙醇，加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，摇匀放置5 min后，加入0.7 mL 10% Al（NO3）3溶液，5 min 后加入5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，混匀，用30%乙醇定容，10 min 后于510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁为标准品绘制标准曲线为y=8.2514x+0.0023，R2=0.9991。根据标准曲线计算黄酮含量。

1.2.4.7 培养料营养成分的测定 纤维素含量测定方法参照国标中的方法[22]。半纤维素、蛋白质、多酚、黄酮、还原糖测定方法同上。

1.3 数据处理

采用Excel 2019 对所得实验数据进行收集和整理，每组实验至少重复3 次，结果表示为平均值±标准差（±s，n≥3），采用Origin 8.5 软件进行作图，采用SPSS 26.0 进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 水分含量对平菇菌丝体生长情况的影响

由表1 可知，随着水分含量的升高，槟榔核组平菇菌丝体长势差别不明显，在含水量为70%时，菌丝洁白度最佳，在含水量为75%时，菌丝洁白度和菌丝密度略有下降。槟榔蒂组在含水量为65%～70%时，菌丝洁白度和菌丝密度最佳，在含水量为75%时菌丝密度降低。其原因可能是随着水分含量的升高，培养基质的孔隙变小，影响菌丝体正常呼吸，从而影响菌丝体长势[23]。

表1 水分含量对平菇菌丝体长势的影响Table 1 Effect of water content on mycelial growth of Pleurotus ostreatus

由图1 可见，使用不同基质栽培平菇，培养料的最适含水量不同。槟榔蒂组整体生长速度高于槟榔核组。随着水分含量的升高，平菇菌丝体长速呈先上升后下降的趋势，其中以槟榔核为替代料的平菇菌丝体长速在水分含量为65%时显著提高（P<0.05），随后生长速度显著降低；以槟榔蒂为替代料时，平菇菌丝体长速在水分含量为70%时达到最高。含水量过低，无法维持食用菌生长所需的水分，若含水量过高，会导致培养料孔隙变小，菌丝体无法正常生长，这与陈秀炳等[24]以棉籽壳为主料栽培杏鲍菇时的研究结果相同。

图1 水分含量对平菇菌丝体生长速度的影响Fig.1 Effect of water content on mycelial growth rate of Pleurotus ostreatus

2.2 粒径大小对平菇菌丝体生长情况的影响

由表2 可知，随着培养料粒径的增大，平菇菌丝体长势整体呈现先强后弱的趋势。槟榔核组在粒径大小为0.15～0.45 cm 之间，菌丝密度和菌丝洁白度较好。槟榔蒂组在粒径大小为0.05～0.45 cm 之间，菌丝密度和菌丝洁白度较好。若培养料粒径过小，培养料颗粒间的孔隙较小，菌丝体无法延伸，无法正常生长，从而影响其浓密程度，导致长势不佳；若粒径过大，菌丝体无法爬丝，从而影响其浓密度，也会影响菌丝体长势。

表2 粒径大小对平菇菌丝体长势的影响Table 2 Effect of particle size on mycelial growth of Pleurotus ostreatus

由图2 可见，使用不同基质栽培平菇，不同粒径大小的培养料对平菇菌丝体生长速度影响不同，随着培养料粒径的增大，平菇菌丝体长速总体呈先上升后下降的趋势，以槟榔核、槟榔蒂为替代料作培养基质的最适粒径大小均为0.15～0.3 cm。培养料粒径较小，通气性较差，会影响菌丝体的长速，粒径较大，菌丝体无法正常生长[25]，这与徐德海[26]利用大豆秸秆栽培平菇，采用较小粒径栽培料进行栽培时，透气性不佳，导致菌丝生长较缓慢、长势较差的研究结论相似。

图2 培养料粒径大小对平菇菌丝体生长速度的影响Fig.2 Effect of particle size of culture medium on the growth rate of Pleurotus ostreatus

2.3 替代料含量对平菇菌丝体生长情况的影响

由表3 可知，随着槟榔副产物替代比例的增加，平菇菌丝体长势逐渐变差，槟榔核组菌丝体洁白度、浓密程度降低。槟榔蒂组菌丝体长势整体优于槟榔核组，其原因可能是槟榔核中有较多的色素，随着替代比例的提高，进入菌丝体中的色素增加，导致颜色加深，进而影响了平菇菌丝体长势。

表3 替代料含量对平菇菌丝体长势的影响Table 3 Effect of substitute material content on mycelial growth of Pleurotus ostreatus

由图3 可见，随着槟榔副产物替代比例的升高，平菇菌丝体的生长速度逐渐下降，当替代比例小于45%时，下降趋势较为缓慢，当替代比例大于45%时，平菇菌丝体长速下降较为显著（P<0.05），这可能是由于食用菌分解吸收槟榔副产物能力与常规培养料相比还是较弱。槟榔核质地较密，培养料孔隙度小，菌丝难以延伸。槟榔核中养分难以很快利用，很难提供速效养分。此外，槟榔核、槟榔蒂中含有槟榔碱和单宁等抑菌物质，培养料中若含量过多对平菇菌丝体生长有一定的抑制作用[27]。

图3 替代料含量对平菇菌丝体生长速度的影响Fig.3 Effect of substitute material content on mycelial growth rate of Pleurotus ostreatus

由以上研究可知，增加槟榔副产物的替代量会降低平菇菌丝体生长速度，但是可以用增加培养天数来解决这一问题。综合考虑菌丝体生长速度、生长势，以及提高槟榔副产物的再利用率、降低平菇生产成本，选择以45%左右替代比例（30%、50%）的副产物含量作为替代料，进行下一步的上袋培养研究，既解决了副产物添加量过多会影响平菇生长周期及生长势的问题，又充分地实现了槟榔加工副产物的再利用价值。

2.4 不同配方栽培料对平菇生物学效率和子实体成分的影响

采用以下条件进行上袋研究：槟榔核作为替代料，培养基质水分含量分别为65%，粒径大小0.15～0.3 cm；槟榔蒂作为替代料，培养基质水分含量分别为70%，粒径大小为0.15～0.3 cm，替代料含量0%、30%、50%为三组进行上袋研究。

2.4.1 对满袋时间和生物学效率的影响 由表4 可知，以槟榔加工副产物为替代料的配方栽培平菇时，平菇在不同配方培养料上均可正常生长，槟榔蒂组生物学效率整体较槟榔核组高，槟榔蒂50%替代组生物学效率最高，可达到88.67%，此外50%替代组生物学效率均高于30%替代组，这可能是由于栽培袋较试管相比松紧度适宜，通气条件好，且出菇时需喷水处理，菌丝体会利用培养料溶解在水中的营养物质，导致槟榔核、槟榔蒂50%组虽长速变慢，但吸收利用的营养物质较30%替代组多，生物学效率较高。槟榔核、槟榔蒂50%替代组满袋时间较长，其原因可能是槟榔核泡水处理发黏，如果加大其用量会使菌包结块粘连，孔隙变小，透气性变差，从而影响生长速度。槟榔核中含有的槟榔碱和单宁等抑菌物质比槟榔蒂高，对前期菌丝生长有一定的抑制作用，可以利用增加培养天数来解决这一问题[28]。

表4 平菇在菌袋中的满袋时间及其生物学效率Table 4 Full bag time and biological efficiency of Pleurotus ostreatus in mycelium mass

2.4.2 对平菇子实体成分含量的影响 由表5 可知，代料栽培的四种平菇子实体中，与对照组相比，多酚、黄酮、多糖含量均显著提升（P<0.05）。槟榔核50%替代组多酚、黄酮含量均为最高，多酚含量可达到51.05 mg/g，与对照组相比提升了53.21%；黄酮含量可达到0.42 mg/g，与对照组相比提升了133%。槟榔核30%替代组多糖含量最高，可达到42.01%，与对照组相比提升了77.10%。槟榔副产物中含有丰富的活性物质，而食用菌具有强大的富集作用，富集了培养料中的活性物质，使平菇子实体具有更丰富的活性成分。试验结果表明添加一定比例（30%、50%）槟榔副产物栽培平菇，平菇子实体中黄酮、多酚等活性成分含量显著提高（P<0.05），能够生产富有功能活性的食品。

表5 不同配方平菇子实体营养成分含量Table 5 Nutrient content of Pleurotus ostreatus fruiting body in different formulas

2.5 栽培前后培养料中营养成分分析比较

由表6 可知，栽培前后培养料中的纤维素、半纤维素、还原糖、黄酮、多酚含量均有不同程度地下降。槟榔蒂50%替代组纤维素和黄酮含量下降幅度最大，下降幅度分别为59.69%和86.70%；槟榔核50%替代组多酚含量下降最大，下降幅度为46.99%。槟榔蒂30%替代组、槟榔蒂50%替代组、槟榔核50%替代组蛋白质含量略有提高，幅度分别为12.89%、25.17%和18.84%。废弃培养料中各种营养成分的含量与栽培前培养料中的各营养成分含量以及平菇生长发育过程中对各成分的转移程度有关[29]。平菇生长发育过程中菌丝体会分泌大量的酶类物质，使平菇废弃培养料中的纤维素、半纤维素等物质含量显著降低[30]。平菇为腐生菌，不能自身合成各种所需的营养物质，需从培养基质中分解各种大分子物质来维持自身生长。菌包中菌丝不能直接对培养基质中的营养进行吸收，而是通过自身分泌的胞外酶对大分子物质进行降解成为可吸收的小分子物质[31−32]。在平菇栽培试验中，槟榔蒂替代组的纤维素利用率整体高于槟榔核组，而槟榔核替代组的半纤维素利用率较高，说明以槟榔核作为替代料栽培食用菌时会较好利用半纤维素进行物质转化，而槟榔蒂替代组反之。试验表明，经栽培，培养料中的多种营养成分成分发生了不同程度的转移，废弃的培养料中仍含有较丰富的蛋白质、纤维素等营养物质，可以进行循环利用[33]。

表6 平菇栽培基质中理化指标的变化Table 6 Changes of physicochemical indexes in Pleurotus ostreatus cultivation substrate

3 结论

槟榔加工副产物可以部分替代常规培养料栽培平菇。当槟榔核作为替代料时，培养基质水分含量分别为65%，粒径大小0.15～0.3 cm 时效果最好。当槟榔蒂作为替代料时，培养基质水分含量分别为70%，粒径大小为0.15～0.3 cm 时效果最好。槟榔核、槟榔蒂以45%左右的比例替代时，既能发挥再利用的价值，食用菌菌丝体生长速度又未减缓太多。

槟榔加工副产物替代料含量为50%时，生物学效率均高于替代料含量30%组，且黄酮、多酚等活性物质含量均有提高。多酚、黄酮含量最高的均为槟榔核50%替代组，分别可达到51.05 mg/g 和0.42 mg/g。利用槟榔加工副产物代料栽培平菇不但解决了资源浪费的问题，还使生产出的平菇具有一定的功能活性。综上比较，副产物替代比例在30%和50%时平菇具有较高的营养成分，会使平菇的品质有所提高。

四组槟榔加工副产物为替代料的栽培试验中，栽培料中多酚、黄酮和多糖含量明显下降，而相应的子实体中多酚、黄酮和多糖较对照组显著提高（P<0.05）。说明平菇子实体转化了培养料中的活性成分且经栽培后培养料还具备一定的利用价值。

试验结果表明槟榔加工副产物可以部分替代普通栽培料培养平菇，并且培养基质中的活性物质可以转化进入平菇子实体中，提高食用菌的功能性成分，此外废弃的培养料中仍然含有多种营养成分，测定结果对开展食用菌废料的综合利用具有一定的参考价值。